青稞叶片原生质体制备体系优化

杨成兰，武雄雄，祁存英，李欣音，张倩倩，段瑞君*

(1.青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016；2.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudum.)占青藏高原作物种植面积的43%，在青藏高原农作物中具有重要地位[1]。随着社会经济的不断发展，青稞成为了藏区草料、酿酒等农产品加工业的重要材料[2]。

植物原生质体被认为是研究基础生命科学及作物育种改良的理想试验材料[3]。植物原生质体瞬时转化体系被广泛应用于细胞瞬时转化、亚细胞定位等试验[4]。原生质体的分离和纯化对原生质体瞬时转化体系起决定性的作用，近年来，有关玉米[5]、苜蓿[6]、小麦[7]等原生质体分离和转染的研究已较为成熟，但对于青稞原生质体分离和转染的研究较少。

酶解法是植物原生质体分离时常用的方法之一。酶解法影响原生质体产量和活力的因素很多，其中甘露醇浓度、酶解时间和离心速度是比较重要的因素。因此，本研究选用青稞幼叶作为研究对象，通过对其原生质体制备过程中各影响因素的调整，分析甘露醇浓度、酶解时间、离心速度和不同苗龄对青稞原生质体产量和活力的影响，旨在确定青稞原生质体制备的最优体系，为利用青稞原生质体做进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

(1)材料。本试验选用由青海大学农林科学院提供的青稞“肚里黄”品种。

(2)试剂。纤维素酶(Cellulase-R10)、果胶酶(Macerozyme-R10)、牛血清蛋白(BSA)、甘露醇、二乙酸荧光素(FDA)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、氯化钙(CaCl2)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)。

1.2 试验方法

1.2.1 正交试验设计 本试验选择3%纤维素酶和1%果胶酶作为酶液组合。以甘露醇浓度、酶解时间、离心速度和不同苗龄为主要因素(表1)，设计4因素3水平L9(34)正交试验，如表2所示。表中各因素各水平均参照文献[8]。

表1 因素水平表

表2 正交试验设计

1.2.2 青稞幼苗的培养 选取20粒饱满的青稞“肚里黄”种子，先用30%H2O2浸泡消毒10 min，再用无菌水冲洗5～7次，随后将种子在培养皿中用无菌水浸泡12 h后转移到纸床(铺好滤纸的培养皿),排列整齐，放置黑暗环境下萌发48 h，期间注意在滤纸变干前浇水(以浇透滤纸为准)；将已萌发的种子转移至改良的Hoagland′s水培体系中室温培养，每隔2 d更换一次新鲜营养液。

1.2.3 青稞原生质体制备 将培养的不同苗龄青稞幼叶沿根部剪下，用75%的酒精对叶片表面进行消毒，然后称取1.5 g并切成0.5～1 mm左右的小碎片，将其放入15 mL酶解液中(3%纤维素酶+1%果胶酶+甘露醇+0.1%MES+1 mmol/L CaCl22H2O+0.1%BSA)，25 ℃、60 r/min黑暗条件放置摇床振荡酶解。待酶解结束，用200目细胞筛过滤去除较大的细胞壁或组织碎片，滤液重新装入15 mL圆底离心管中，25 ℃离心5 min，收集管底沉淀物，弃上清。向管底加入3 mL W5(154 mmol/L NaCl+125 mmol/L CaCl22H2O+5 mmol/L KCl+2 mmol/L MES，pH 5.7)溶液清洗3次，离心弃上清；最后向管底加入1 mL W5溶液将沉淀进行吹打混匀，获得纯化的原生质体。

原生质体产量和活力的测定参照尹红新[9]和彭小群等[10]方法。

2 结果与分析

2.1 最优条件的确定

根据正交试验结果与极差分析可知(表3)，甘露醇浓度的R值最大，说明甘露醇浓度对青稞叶片原生质体影响较大；其次为酶解时间和离心速度，酶解时间过长、离心速度过大都会导致细胞碎片增多，影响青稞叶片原生质体活力；不同苗龄对青稞叶片原生质体产量影响较小。综合考虑，上述4个因素对青稞叶片原生质体的影响主次顺序为甘露醇浓度>酶解时间>离心速度>不同苗龄。

表3 正交试验结果与极差分析

2.2 LSD多重比较分析

对各因素各水平进行LSD多重比较分析。甘露醇浓度太高或太低都会影响原生质体分离的效果，当甘露醇浓度为0.5 mol/L时，分离的原生质体产量和活力都最好，显著高于其他两组(图1a)；如图1b所示，酶解5 h时原生质体产量和活力都最高，继续增加酶解时间(6 h)，原生质体产量开始下降，活力也随之减少；通过500、900、1 200 r/min离心速度对原生质体分离的研究发现，完整原生质体产量和活力在900 r/min时最好(图1c)；以培养5、7、9 d的青稞幼叶为材料，分析不同苗龄对原生质体产量和活力的影响，从图1d可以看出，不同苗龄的青稞幼叶原生质体产量和活力没有明显差异，这可能与极差最小有关，说明相差一两天的培养天数对其产量和活力影响并不大。结合上述分析，确定制备青稞叶片原生质体的最优条件：培养7 d的青稞幼叶为材料，酶解液由3%纤维素酶+1%果胶酶+0.5 mol/L甘露醇+0.1% MES+1 mmol/L CaCl22H2O+0.1% BSA组成，25 ℃，60 r/min，黑暗酶解5 h后，用900 r/min离心5 min收集。

图1 不同因素水平下原生质体产量和活力的均值比较Fig.1 Comparison of mean yield and activity of protoplast at different factor levels

2.3 最优条件下分离的原生质体

通过正交试验设计和LSD多重比较分析，确定分离原生质体过程中4个影响因素的最优条件。将培养7 d的青稞幼叶放入含有0.5 mol/L甘露醇的酶解液中，黑暗酶解5 h，然后以900 r/min的离心速度收集细胞，对分离的原生质体产量和活力进行统计观察(图2)，结果显示在最优条件下分离的原生质体产量可达3.2×106个/g，活力约为85.42%。同时，分离出来的完整原生质体呈饱满的圆球形(图2a)，通过FDA染色会发出绿色荧光(图2b)。

图2 最优条件下青稞原生质体的显微观察Fig.2 Microscopic observation of Hordeum vulgare L.var.nudum.protoplast under the optimal condition

3 讨论与结论

原生质体制备过程中，甘露醇浓度过高细胞质会失水过度而皱缩，浓度过低会导致细胞质胀裂破碎。赵红娟等[6]在苜蓿子叶原生质体分离中使用的甘露醇浓度为0.2～0.8 mol/L，本研究使用的甘露醇浓度为0.5 mol/L，此条件下分离的原生质体细胞壁破碎完全，细胞质周围环境稳定，最终收获的原生质体大多呈饱满球形，活力较高。彭小群等[10]的研究发现酶解时间的长短对分离原生质体影响较大。本研究中青稞幼叶酶解4 h时只有很少量的细胞壁碎片，酶解6 h时产量虽有所提高，但细胞碎片数量过多，影响细胞质的活力。因此，确定原生质体分离的最佳酶解时间为5 h，该时间段完整细胞质产量多、碎片少、活力高。收集原生质体时离心速度太小会导致其沉淀不完全，离心速度太大会使过早沉淀下来的原生质体被压实且破碎[11]。本试验中当离心速度为900 r/min，离心5 min时，原生质体沉淀最为彻底，最终获得的完整原生质体产量最多。不同苗龄的青稞幼叶对原生质体产量和活力影响不大，培养7 d的青稞幼叶分离的原生质体产量和活力均较高。

建立高效的原生质体分离纯化体系对于亚细胞定位、体细胞杂交和瞬时表达等试验十分重要[12]。本研究确定的最优条件为纤维素酶3%，果胶酶1%，甘露醇浓度0.5 mol/L，酶解时间5 h，离心速度900 r/min，从培养7 d的青稞幼叶中分离出的细胞质呈圆球形，多为淡绿色，分布均匀，产量可达3.2×106个/g，活力约为85.42%。