缺血性脑卒中患者血清miR-17-5p、miR-27b-3p水平及其对中重度颅内外动脉狭窄预测价值

徐 丽，毛居旦·阿不力孜，杨 丽

缺血性脑卒中是一种因脑组织供血障碍引起脑组织坏死从而导致神经功能障碍的临床综合征，约占所有卒中的70%，近年其发病率逐年升高，给社会及家庭带来严重负担[1]。有研究显示，缺血性脑卒中的发病因素较多，颅内外动脉狭窄是其发病重要病理生理基础[2]。颅内外动脉狭窄通常由动脉粥样硬化引起，随着动脉粥样硬化发展，颅内外动脉狭窄发生概率逐渐升高，患者发生缺血性脑卒中风险也随之加大[3]。因此，临床上对颅内外动脉狭窄的评估显得尤为重要。有研究发现，微小RNA(miRNA)作为一种基因调控分子，在缺血性脑卒中的发生和发展过程中发挥重要作用，有望作为缺血性脑卒中诊断的新型生物学标志物[4]。然而，目前有关血清miRNA水平与缺血性脑卒中患者颅内外动脉狭窄程度关系方面的研究及血清miRNA水平检测对颅内外动脉狭窄诊断价值方面的研究较少。本研究探讨缺血性脑卒中患者血清miR-17-5p、miR-27b-3p水平及其对中重度颅内外动脉狭窄预测价值，旨在为缺血性脑卒中的早期诊断及防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年1月—2020年6月新疆维吾尔自治区人民医院收治的符合纳入及排除标准的缺血性脑卒中136例的临床资料。纳入标准：①符合缺血性脑卒中诊断标准[5]，且均经头颅CT或MRI检查确诊；②性别不限，年龄≥18岁；③首次发病，发病至入院时间≤72 h，且入院前未接受过溶栓治疗；④临床资料完整；⑤患者和(或)其家属签署相关知情同意书。排除标准：①因非动脉粥样硬化因素导致的缺血性脑卒中患者；②有神经系统疾病史患者；③合并重要脏器功能障碍和恶性肿瘤患者；④合并血液系统或自身免疫系统疾病患者。本研究符合“赫尔辛基宣言”，并经医院医学伦理委员会批准同意执行。

1.2研究方法

1.2.1一般资料收集：收集入选患者性别、年龄、体质量指数(BMI)、基础疾病(高血压病、糖尿病和心房颤动)、发病至入院时间、入院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分、吸烟史和饮酒史。吸烟史：每天吸烟≥1次，持续时间≥2年；饮酒史：平均每日饮酒量≥50 g，持续时间≥1年。

1.2.2一般实验室指标检测：入选患者一般实验室指标检测均于入院后24 h内完成。采集入选患者晨起肘静脉血5 ml，2500 r/min离心5 min，分离血清后，低温保存待测。采用全自动生化分析仪(7020型，日本日立有限公司生产)检测入选患者一般实验室指标，包括尿酸、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.2.3血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平检测：采集入选患者晨起肘静脉血5 ml，2500 r/min离心5 min，分离血清后，低温保存待测。应用miRNeasy Mini Kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)提取血清总RNA，采用紫外分光光度计(DU800型，美国贝克曼库尔特有限公司生产)测定RNA浓度及纯度，检测波长为260或280 nm，以稀释RNA的无酶水为空白对照，吸光度值为1.8～2.1表明RNA质量合格。总RNA经凝胶电泳分离、纯化，后逆转录为互补DNA(cDNA)，逆转录条件为16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、10 min，获得cDNA后于-20℃保存备用。应用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司生产)，采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平，反应体系：2×miRcute miRNA Premix 10 μl、0.4 μl正向引物(10 μmol/L)、0.4 μl反向引物(10 μmol/L)、2 μl miRNA第1链cDNA、1.6 μl ROX参比染料(50×)、5.6 μl双蒸水，总反应体系20 μl；循环参数：94℃预变性2 min为1个循环;94℃ 20 s、60℃ 34 s，共计43个循环。miRNA表达结果采用2-ΔΔCt计算[6]，每个样本检测3次，取平均值。

1.2.4数字减影血管造影(DSA)检查：应用DSA机(Artic Zee Ceiling，德国西门子股份有限公司生产)对入选患者颅内外动脉狭窄情况进行检查，采用改良Seldinger技术穿刺患者一侧股动脉，插入5F动脉鞘行主动脉弓造影，Hunter导管分别置于双侧颈总动脉、椎动脉和颈内动脉，注入造影剂(碘海醇)后造影。造影剂注入速度为5～20 ml/s，总量为5～30 ml，压力为200～700 Pa。

1.2.5颅内外动脉狭窄情况评估：由2名经验丰富的影像科医师对DSA图像进行双盲分析，对不确定的影像资料，采取协商方式统一意见。血管狭窄率=(正常血管直径-狭窄部位最小直径)/正常血管直径×100%，以血管狭窄率<30%为轻度狭窄，血管狭窄率30%～70%为中度狭窄，血管狭窄率≥70%为重度狭窄[5]。根据颅内外动脉是否狭窄将入选的缺血性脑卒中136例分为狭窄组和对照组两组，根据颅内外动脉狭窄程度将狭窄组分为轻度狭窄组、中度狭窄组和重度狭窄组3个亚组。

2 结果

2.1狭窄组和对照组临床资料比较 缺血性脑卒中136例经DSA检查共检出颅内外动脉狭窄95例(狭窄组)，无颅内外动脉狭窄41例(对照组)。狭窄组血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。两组性别、年龄、BMI、基础疾病、发病至入院时间、入院时NIHSS评分、吸烟史、饮酒史和血清TG、HDL-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2不同颅内外动脉狭窄程度缺血性脑卒中3组临床资料比较 颅内外动脉狭窄95例中，共检出轻度狭窄28例(轻度狭窄组)，中度狭窄31例(中度狭窄组)，重度狭窄36例(重度狭窄组)。不同颅内外动脉狭窄程度缺血性脑卒中3组血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平总体比较差异有统计学意义(P<0.01)；性别、年龄、BMI、基础疾病、发病至入院时间、入院时NIHSS评分、吸烟史、饮酒史和血清TG、HDL-C水平总体比较差异无统计学意义(P>0.05)。血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平轻度狭窄组和中度狭窄组低于重度狭窄组，轻度狭窄组低于中度狭窄组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 不同颅内外动脉狭窄程度缺血性脑卒中3组临床资料比较

2.3血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者联合检测对缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄预测价值 绘制ROC曲线分析血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者联合检测对缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄的预测价值，结果显示对缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄预测价值的AUC血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者联合检测分别为0.677、0.688和0.804，血清miR-17-5p和miR-27b-3p二者联合检测明显高于单独检测(P<0.05)，见图1和表3。

图1 血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者联合检测对缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄预测价值的受试者工作特征曲线

表3 血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者联合检测对缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄预测价值的受试者工作特征曲线分析结果

3 讨论

流行病学研究发现，20%～48%的缺血性脑卒中由颅内外动脉狭窄引起，且多数复发性病例也发生于相同的动脉狭窄供血区域[7-8]。患者发生动脉粥样硬化后，斑块内新生血管破裂后形成血栓，使动脉狭窄或完全阻塞，导致脑部供血中断，引发缺血性脑卒中；此外，颅内外动脉狭窄造成慢性脑灌注不足也增加了缺血性脑卒中的发生风险[9-10]。因此，准确评估颅内外动脉狭窄程度对缺血性脑卒中临床治疗具有重要意义。

miRNA广泛参与机体基因表达转录后的调控过程，在免疫损伤、神经退行性疾病和肿瘤等的发生和发展过程中发挥重要作用。现有研究显示，miR-17-5p表达异常与心肌梗死后血管形成有关[11]；miR-27b-3p在肥胖人群中呈高表达，在棕色脂肪细胞分化过程中发挥重要调节作用，是治疗肥胖和胰岛素抵抗的潜在靶点[12]。本研究分析缺血性脑卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平，结果显示狭窄组miR-17-5p和miR-27b-3p水平均高于对照组，差异有统计学意义。提示颅内外动脉狭窄缺血性脑卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平较高，血清miR-17-5p和miR-27b-3p可能为评估颅内外动脉狭窄的潜在生物学标志物。Tan等[13]以动脉粥样硬化小鼠为研究对象进行研究，发现动脉粥样硬化小鼠血清miR-17-5p水平明显升高，极低密度脂蛋白受体(VLDLR)水平有所下降；且拮抗miR-17-5p后，动脉粥样硬化小鼠VLDLR下降情况有所恢复，推测VLDLR是miR-17-5p的直接靶点，miR-17-5p抑制剂可通过上调血清VLDLR水平，缓解动脉粥样硬化病理改变情况。极低密度脂蛋白(VLDL)由TC、TG和胆固醇酯等组成，以TG占比最高，当VLDL水平升高时，TC和TG水平也明显升高，导致缺血性脑卒中发生率升高[14]。本研究结果显示狭窄组TC水平高于对照组，也证实了这一观点。miR-27b-3p是血管平滑肌细胞表型转换的重要调控miRNA，其表达水平升高可抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移[15]。Cheng等[16]研究急性缺血性脑卒中诊断的潜在生物学标志物，发现与健康者相比，急性缺血性脑卒中患者血清miR-27b-3p水平显著升高，认为血清miR-27b-3p是诊断缺血性脑卒中的良好血源性生物标志物。

本研究进一步分析不同颅内外动脉狭窄程度缺血性脑卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平发现，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平轻度狭窄组和中度狭窄组低于重度狭窄组，轻度狭窄组低于中度狭窄组，差异均有统计学意义。提示血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平与缺血性脑卒中患者颅内外动脉狭窄密切相关，颅内外动脉狭窄程度越高，二者表达水平越高。分析其原因：①缺血性脑卒中发生后，缺血半暗带内细胞在氧化应激作用下会产生大量自由基，抑制新生血管形成，参与动脉粥样硬化发病机制，而miR-17-5p在氧化应激中表达上调[17]；②胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平升高与缺血性脑卒中病情有密切关系，IGF-1可刺激血管平滑肌增殖及迁移，促进动脉粥样硬化形成，使患者发生颅内外动脉狭窄，而miR-27b-3p高表达会影响IGF-1结合蛋白对IGF-1的调控，增加患者发生动脉粥样硬化的风险，使动脉狭窄程度加重[18]。

本研究ROC曲线分析结果显示，对缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄预测价值的AUC血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者联合检测分别为0.677、0.688和0.804，血清miR-17-5p和miR-27b-3p二者联合检测明显高于单独检测。提示血清miR-17-5p和miR-27b-3p可作为预测缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄的良好指标。因此，临床可根据缺血性脑卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平评估颅内外动脉狭窄情况，以及时采取相应干预措施，改善患者预后。

总之，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平与缺血性脑卒中患者颅内外动脉狭窄密切相关，颅内外动脉狭窄程度越高，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平越高。血清miR-17-5p和miR-27b-3p联合检测对缺血性脑卒中患者中重度颅内外动脉狭窄预测价值高于血清miR-17-5p和miR-27b-3p单独检测。