基于网络药理学对夏枯草治疗甲状腺结节的分子机制研究

李蓉，张艳娇，张蕾，范源

(1.云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 650216)

甲状腺结节(thyroid nodule)是甲状腺内所形成的结节状肿块或包块，可随吞咽动作而上下移动，属于临床常见的病症。其发病因素主要有增生性结节性甲状腺肿、肿瘤性结节、炎症性结节以及囊肿等[1]，发病多见于中青年人群，高发于30～50岁的女性。其病因和发病机制较复杂，大量研究发现与遗传、年龄、性别、碘摄取量、肥胖、代谢紊乱等因素相关[2]；中医学称甲状腺结节为“瘿病”,其表观是由气滞血瘀痰凝壅结于颈前所致,根本则在于以肝脾肾为主的脏腑功能失调及不足[3]。中医药治疗甲状腺结节可改善中医临床症状，缩小结节体积，降低恶变率，黄盛等[4]分析的103首治疗甲状腺结节的方剂中，夏枯草的使用频次最高，为74次。张锦明[5]研究发现，使用单纯的夏枯草口服溶液可使甲状腺结节的体积缩小。可见夏枯草已作为治疗甲状腺结节的首选药物。甲状腺结节危害人类健康，所以尽早地诊断和治疗，可增加甲状腺结节的治愈率，同时也可预防甲状腺癌的发生。

夏枯草(Prunellavulgaris)为唇形科(Lamiaceae)植物夏枯草的干燥果穗，是一种多年生的植物，在《滇南本草》里面又被称为麦夏枯、铁线夏枯，始载于《神农本草经》，具有清肝明目、散结、消肿、止痛等作用，用于治疗目赤肿痛、眩晕、急性黄疸、甲状腺肿大、淋病、乳腺增生、高血压、结核病、肝炎等疾病[6-7]。现代研究表明，夏枯草中含有多种化学成分，萜类、酚酸类、黄酮类、甾醇类、香豆素类、有机酸类、挥发油及糖类等多种成分已被分离出来，其中萜类、黄酮类为最主要的活性物质[8]。夏枯草及其复方有着多成分、多途径、多靶点作用机制的特点，在研究癌症等疾病方面有一定的局限性。近年来，随着计算机科学与网络技术的发展，人们已逐渐将信息学分析方法用于药物与疾病研究的范畴。

网络药理学(network pharmacology)概念应运而生,其由Andrew L Hopkins于2007年首次在Nature Biotechnology上被提出[9]。它是在系统生物学与计算机技术高速发展的基础上发展起来的，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上,通过网络分析,系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响,揭示多分子药物协同作用于人体的奥秘[10]。网络药理学从整体、系统角度去探索“药物-疾病”的关联性,寻找药物的主要靶点,利用生物学数据库进行科学、系统的分析，明确药物治疗疾病的机制。本实验基于网络药理学大数据库来探讨夏枯草抗甲状腺结节的作用机制，为后期治疗甲状腺结节新药的研发提供一定的参考，也为临床治疗甲状腺结节提供新的理论依据。

1 实验方法

1.1 夏枯草的活性成分及靶点筛选 利用TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，检索夏枯草中所含的所有化学成分，将数据库中的口服利用度(OBioavail,OB)和类药性(drug-likeness,DL)作为筛选的关键参数[11]，将OB值≥30%和DL值≥0.18作为筛选的限定条件，筛选口服生物利用度高且药物相似性较好的化合物。利用Uniprt数据库(https://www.uniprot.org/)，将夏枯草活性成分靶点的蛋白名转化为基因名，去除重复项，所得即是夏枯草潜在作用靶点。

1.2 预测夏枯草抗甲状腺结节潜在的作用靶点 在Genecard数据库(https://www.genecards.org/)中以“thyroid nodule”为关键词检索，以中位数进行筛选，去除重复项后得到甲状腺结节疾病的潜在靶点。将药物作用靶点与甲状腺结节的靶点导入Venn数据(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)库进行分析。

1.3 构建夏枯草的相关活性成分—作用靶点网络图 为建立夏枯草化合物和基因之间的相关性，把夏枯草的活性成分与甲状腺结节的靶点导入Cytoscape 3.8.0软件，构建夏枯草抗甲状腺结节疾病的活性成分—作用靶标网络结构图。

1.4 夏枯草抗甲状腺结节蛋白相互作用的网络构建与分析 为确定夏枯草与甲状腺结节疾病的相互作用关系，将潜在靶点导入String数据库(https://string-db.Org/)，物种选定为“Homo sapiens”，获得蛋白相互作用关系，设置信度分值大于0.7，隐藏无蛋白互作关系的靶点，以TSV格式保存结果。再将数据导入Cytoscape 3.8.0软件进行可视化处理和分析[12]。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 通过Gene ontology(GO)分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析，探讨夏枯草的核心作用机制及相关生物学通路。用Metascape数据库(https://metascape.org/)进行GO和KEGG富集分析，物种选择“H specises”，查阅相关文献，选择富集P值小于0.01的功能注释进行进一步分析[13](P值反映生物功能的显著性及通路的富集程度，P值越小，则富集结果显著性越高)。获得生物过程、细胞组成、分子功能和关键的信号通路。

2 实验结果

2.1 夏枯草活性成分的靶点筛选 本实验使用TCMSP 数据库检索得到60个夏枯草的化学成分，根据药代动力学参数的筛选限定条件(OB≥30%，DL≥0.18)，可得11个夏枯草活性成分(结果如表1所示)，无活性的化学成分有49个，根据筛选靶点的结果可知，靶点最多的活性成分为槲皮素、山柰酚与β-谷甾醇。

表1 筛选出的夏枯草的主要活性成分

2.2 夏枯草抗甲状腺结节作用靶点的预测 使用Genecard数据库分析，筛选出与甲状腺结节相关的基因共2 775个，取中位数及去除重复项后所得基因有626个，将所得甲状腺结节的626个相关靶点与夏枯草208个活性成分靶点取交集，得到78个共有的基因靶点，即夏枯草抗甲状腺结节的作用靶点可能有78个(结果如图1、表2所示)。

图1 “夏枯草抗甲状腺结节”基因映射Venn

表2 78个共有基因靶点

2.3 夏枯草抗甲状腺结节的相关活性成分—作用靶点网络图的构建与分析 采用Cytoscape 3.8.0分析软件，构建夏枯草活性成分—作用靶点网络图(结果如图2所示)，其中红色节点表示夏枯草名称的缩写，黄色节点表示夏枯草活性成分(共11个)，绿色节点表示夏枯草抗甲状腺结节的基因靶点(共208个)，边线部分表示两者之间的相互关系。

图2 夏枯草抗甲状腺结节活性成分—靶点网络图

2.4 夏枯草抗甲状腺结节蛋白互作网络的构建与分析 利用String 数据库分析夏枯草治疗甲状腺结节的蛋白间相互作用的网络图构建(结果如图3所示)，由分析结果显示，PPI网络中包含结点为78个，各结点之间包含1 410个蛋白互作关系；利用Cytoscape 3.8.0分析软件进行PPI可视化分析(结果如图4所示)，利用MCODE插件计算Degree值大小，不同形状代表不同组别的基因，该类别颜色越深的基因表明该靶点越重要；得到下图所示的基因：MAPK8、AKT1、EGF、TP53、MAPK1、MMP2、TNF等，夏枯草可能通过分析所示的关键基因发挥抗甲状腺结节的作用。

图3 PPI蛋白互作网络结构图

图4 PPI可视化分析图

2.5 夏枯草抗甲状腺结节基因的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 利用Metascape数据库进行GO功能分析(结果如图5～7所示)，由分析结果显示，夏枯草抗甲状腺结节基因的生物过程主要富集在对有毒物质的反应，对脂多糖的反应，应对受伤，对无机物质的反应，细胞对有机循环化合物的反应等；细胞组成主要富集在膜筏、细胞器外模、血小板α颗粒、质膜外侧、细胞外基质等；分子功能主要富集在细胞因子受体结合、蛋白域特异性结合、转录因子结合、蛋白激酶活性等。利用Metascape数据库进行KEGG通路分析(结果如图8～9所示)，分析可获得相关通路，由图可以看出，夏枯草治疗甲状腺结节富集的信号通路主要在癌症、TNF、PI3K-Akt、MAPK、P53等。

图5 夏枯草抗甲状腺结节的GO生物过程富集图

图6 夏枯草抗甲状腺结节的GO细胞组成富集图

图7 夏枯草抗甲状腺结节的GO分子功能富集图

图8 夏枯草抗甲状腺结节富集的KEGG信号通路图

图9 夏枯草抗甲状腺结节通路富集分析图

3 讨论

本实验对夏枯草有效成分关键靶点进行预测，结合甲状腺结节相关靶点进行分析，提高了夏枯草抗甲状腺结节的科学性。数据分析得夏枯草化学成分共60个，经药动学参数筛选得有效活性成分11个，分别为β-谷固醇、山柰酚、菠那甾醇、豆甾醇、翠雀素、木犀草素、伏沙黄素-1、多孔甾醇、葡萄糖苷、豆甾7-烯醇、桑色素和槲皮素。其中靶点最多的为黄酮类化合物，即槲皮素和山柰酚，据报道，黄酮类化合物具有较好的抗氧化作用，可有效清除自由基，维持机体内环境稳定；还具有抗肿瘤[14]、降血压[15]、神经保护[16]和抗癌[17-18]等多种药理作用，即表明夏枯草可有效改善甲状腺结节的临床症状。

通过PPI网络构建发现，夏枯草可能通过MAPK8、AKT1、EGF、TP53、MAPK1、MMP2、TNF等关键靶点发挥抗甲状腺结节的作用。其中MAPK8、AKT1、EGF为最重要的靶点，有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是MAKPs家族的重要成员之一，可磷酸化并激活转录因子激活子蛋白1(AP-1),进而激活下游一系列基因的表达,在细胞的增殖、分化、生存等过程中起着重要的调控作用[19]。Yang等[20]的研究发现，MAKP1与原代结肠癌细胞的增殖等有关，即具有作为药物治疗靶点的潜力[21]。蛋白激酶B(AKT)参与细胞的增殖和生长以及多种生理功能，存在于炎症代谢信号通路，且异常活化的AKT会导致肿瘤的发生[22]。EGF是一种胃肠黏膜产生的内源性保护因子，王介营等[23]研究发现，EGF及其受体可在丹参酮中抑制甲状腺癌细胞增殖。

GO分析可知，夏枯草抗甲状腺结节涉及诸多的生物过程，分子功能和细胞组成，最主要的生物过程包含对有毒物质的反应，对脂多糖的反应，对伤害的反应，对无机物质的反应，细胞对有机循环化合物的反应等；分子功能包含细胞因子受体结合、蛋白域特异性结合、转录因子结合、蛋白激酶活性等；细胞组成主要包含膜筏、细胞器外模、血小板α颗粒、质膜外侧、细胞外基质等。其中分子功能较为关键，而且可能在靶细胞的多个区域特别是与膜系统有关的亚细胞区域发挥作用[24]。

KEGG通路富集分析可知，夏枯草治疗甲状腺结节主要集中在癌症途径、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、膀胱癌、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、麻疹、疟疾、MAPK信号通路、P53信号通路等。梁书卿等[25]的研究表明，MAPK和PI3K-Akt信号通路的过度激活，可能会增加甲状腺癌的发生、发展及转移，且PI3K-Akt信号通路的异常活化与甲状腺癌的发展速度有着密切的联系。陈丽君[26]关于研究结节性甲状腺肿发病机制的研究中表明，PI3K/Akt信号转导通路激活过度会导致甲状腺结节发生病变，即该因素被认为是最常见的结节性甲状腺肿发病因素。以上结果表明，夏枯草可通过多个因子，调节多条信号通路来发挥抗甲状腺结节的作用。

实验运用生物信息学数据库分析，可看出夏枯草抗甲状腺结节涉及多靶点，诸多生物过程及多种信号通路的富集，说明夏枯草抗甲状腺结节的作用机制较为复杂。目前甲状腺结节的发病机制尚不明确，西医多采用手术、放射性碘等手段治疗甲状腺结节，但会引起甲状腺功能减退等症状，随着中医药的发展，中药治疗甲状腺结节的研究逐渐被报道。本次实验基于网络药理学的研究方法，对夏枯草抗甲状腺结节的分子机制进行初步探讨，为后期甲状腺结节疾病的治疗提供了一定的理论依据。