昆布散对甲状腺肿大大鼠甲状腺功能及氧化应激的影响

赵慎非,黄莉莉,黄鸣清,张怡评,林思荣,邱远望

(1.福建省食品药品质量检验研究院，福建 福州 350001；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108；3.自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心,福建 厦门 361005；4.福建中益制药有限公司，福建 石狮 362712)

甲状腺是人体最大的内分泌器官，其分泌的甲状腺素是人体生长发育和新陈代谢不可缺少的激素[1]。甲状腺肿是临床上常见的甲状腺疾病，是由于甲状腺上皮细胞增生而形成的甲状腺肿大，以颈前喉结两旁结块肿大为主要特征，女性显著高发，高发年龄为20～50岁，严重影响了患者的生活和工作[2]。甲状腺肿大的原因主要有碘摄入不足、甲状腺肿瘤等甲状腺疾病诱发、药物或食物导致甲状腺激素合成障碍[3]。其临床治疗多采用手术治疗，术后长期服用左甲状腺素钠，但伴有诸多不良反应，复发率较高。

中医学认为，甲状腺肿在中医学中属“气瘿”范畴，其多因情志内伤、饮食及水土失宜，以致肝郁日久，气机不畅，津液凝聚成痰，痰气交阻，结于颈部而成。传统中医药对该病的治疗具有悠久历史，其治疗原则为理气化痰、软坚散结、活血化瘀[4]。昆布散为中医经典方剂，收录于宋代《圣济总录》，由昆布、海藻、松萝、海蛤、木通、白蔹、桂枝组成，主治气瘿初结，现代临床常用于治疗甲状腺肿大，疗效确切。然而，目前尚缺乏昆布散抗甲状腺肿大相关药理实验研究的科学数据，无法对其临床推广及新药开发提供指导作用。因此，本研究通过建立丙硫氧嘧啶所致大鼠甲状腺肿大模型，深入探讨昆布散对大鼠甲状腺肿大的治疗作用及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠(180～200 g)72只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供[生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005]，饲养于福建中医药大学实验动物中心。饲养温度24～26 ℃，湿度45%～55%，饮水与饲料充足，适应性喂养7 d。医学实验动物环境设施许可证号：SYXK(闽)2019-0007。本研究的动物实验操作符合动物实验伦理要求。

1.2 药物及试剂 昆布散药液：取处方量昆布30 g、海藻30 g、松萝10 g、海蛤20 g、木通20 g、白蔹20 g、桂枝20 g，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩实验所需浓度。丙硫氧嘧啶片(上海朝晖药业有限公司，批号：208936)，使用时以生理盐水配制为1 mg·mL-1溶液。左甲状腺素钠片(德国默克公司，批号：199818)，使用时以生理盐水配制为2 μg·mL-1溶液。

三碘甲状腺原氨酸(T3)试剂盒(批号：H222)、甲状腺素(T4)试剂盒(批号：H223)、促甲状腺激素(TSH)试剂盒(批号：H087)，均购自南京建成生物工程研究所。Keap1(4678S)、HO-1(43966)、β-actin(3700)，购自美国CST公司；NQO-1(ab28947)、兔二抗、鼠二抗均购自美国Abcam公司。

1.3 仪器 XY2000C电子天平(常州市幸运电子设备有限公司)、SK-1快速混匀器(常州国华电器有限公司)、Infinite 200 PRO多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)、ChemiDoc XRS+ 化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)、Micro17R台式高速冷冻离心机(美国赛默飞公司)。

2 方法

2.1 造模方法与分组给药 除正常对照(Sham)组大鼠外，其余大鼠随机分为模型组(Model)、左甲状腺素钠组(LTS)、昆布散低剂量组(KBS-L)、昆布散中剂量组(KBS-M)、昆布散高剂量组(KBS-H)(n=12)，每天灌服丙硫氧嘧啶溶液(10 mL·kg-1)1次，连续造模14 d。造模成功后，空白组和模型组每天灌服等量的生理盐水，LTS组按20 μg·kg-1体重灌服左甲状腺素钠片溶液，KBS-L、KBS-M、KBS-H组分别按每千体重5.87、11.56、23.14 g生药灌服昆布散药液，灌胃体积均为10 mL·kg-1，连续给药28 d。每周称重1次，以调整给药量。

2.2 样本采集及指标检测 末次给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，称重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血3～5 mL，以3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，采用放射免疫法测定大鼠血清中T3、T4、TSH水平。

处死动物后，迅速取出甲状腺，电子天平称湿重，计算甲状腺系数(甲状腺系数=甲状腺重量mg/大鼠体重g×100)。

各组随机选取6份甲状腺，根据其重量加入适量预冷的PBS，研磨均匀，制成10%的甲状腺组织匀浆液，采用比色法测定大鼠甲状腺组织中MDA、SOD水平。

2.3 Western Blot检测大鼠甲状腺Keap1、HO-1、NQO-1蛋白表达 选取各组剩余6份甲状腺，称重后切成碎块放入匀浆器，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液，在冰上充分研磨裂解后，4 ℃离心10 min，上清即为蛋白提取液，用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。将制备好的蛋白样品于100 ℃变性10 min，冷却至室温后用SDS-PAGE进行电泳，上样总量为30 μg。电泳结束后，分别进行转膜、封闭、孵育一抗、洗涤、孵育二抗，洗涤后用化学发光法检测各组样品Keap1、HO-1、NQO-1蛋白条带，以β-actin为内参，用Image Lab 6.0分析灰度值。

3 结果

3.1 昆布散对大鼠甲状腺湿重、甲状腺系数的影响 连续给药28 d后，与正常组比较，模型组大鼠的甲状腺湿重和甲状腺系数明显增大(P<0.01)。与模型组相比，各给药组大鼠的甲状腺湿重和甲状腺系数均有所降低，但差异未见显著统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 昆布散对大鼠甲状腺湿重、甲状腺系数的影响

3.2 昆布散对大鼠血清甲状腺激素水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中T3、T4水平显著降低(P<0.01)，TSH水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，左甲状腺素钠组和昆布散中、高剂量组大鼠血清中T3、T4水平显著升高(P<0.01)，TSH水平显著下降(P<0.05或P<0.01)；昆布散低剂量组大鼠血清中各指标均有所改变，但差异未见显著统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 昆布散对大鼠血清中T3、T4、TSH水平的影响

3.3 昆布散对大鼠甲状腺组织中SOD、MDA水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠甲状腺组织中SOD水平明显下降(P<0.01)，MDA水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，左甲状腺素钠组和昆布散各剂量组SOD水平均显著上升(P<0.05或P<0.01)，MDA水平显著下降(P<0.05或P<0.01)(见表3)。

表3 昆布散对大鼠甲状腺组织MDA、SOD水平的影响

3.4 昆布散对大鼠甲状腺Keap1、HO-1、NQO-1蛋白表达的影响 如图1所示，与正常组比较，模型组大鼠甲状腺组织中Keap1蛋白表达水平显著增高(P<0.01)，HO-1和NQO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较，昆布散低、中、高剂量组大鼠甲状腺组织中Keap1蛋白表达水平明显降低增高(P<0.01)，而HO-1和NQO-1蛋白表达水平则明显增高(P<0.01)，且呈一定剂量依赖性；左甲状腺素钠组则表现出与昆布散各剂量相似的药理效应(P<0.01)。

Sham：正常组；Model：模型组；LTS：左甲状腺素钠组；KBS-L：昆布散低剂量组；KBS-M：昆布散中剂量组；KBS-H：昆布散高剂量组

4 讨论

甲状腺肿大是由于多种原因导致的甲状腺体积或形态变大，目前以手术和药物治疗为主的治疗方式存在诸多不足[5]。甲状腺的主要功能是合成甲状腺激素，其中T4、T3具生物学活性，参与调节机体内环境；而TSH参与调节促甲状腺激素分泌，其水平升高时表示甲状腺激素分泌不足[6]。本实验利用丙硫氧嘧啶作为造模药，其原理是抑制甲状腺内过氧化物酶系统，阻断甲状腺中酪氨酸的碘化和碘化酪氨酸的缩合，从而抑制甲状腺激素的合成。结果表明，与正常大鼠相比，模型大鼠血清T4、T3水平明显降低，TSH水平明显升高；而昆布散治疗则显著上调模型大鼠T4、T3水平，降低TSH水平，表明昆布散可明显改善甲状腺肿大大鼠的甲状腺功能。

当机体发生过度氧化应激损伤时，会生成过多ROS，抗氧化系统不足以及时抗衡，还会导致脂质过氧化，催化裂解产生毒性醛基产物MDA[7]。而SOD是体内的自由基清除剂之一，可有效降低胞内ROS水平，抑制氧化应激反应。本实验结果显示，昆布散可明显上调模型大鼠甲状腺SOD水平，降低MDA含量，提示昆布散可促进甲状腺肿大大鼠甲状腺内氧自由基的清除，并抑制脂质过氧化。研究表明，Keap1/HO-1/NQO-1通路是甲状腺中氧化应激反应的主要发生途径之一[8-9]。Keap1敲除后的甲状腺滤泡细胞系中NQO-1的mRNA表达水平显著降低[10]；HO-1作为血红素分解代谢过程中的限速酶，在细胞中发挥抗氧化、抗炎的特性[11]，其下游的NQO-1可参与调节胞质氧化还原状态，从而发挥维持细胞稳态的作用。本实验发现，昆布散可明显降低模型大鼠甲状腺Keap1蛋白表达，升高HO-1和NQO-1的蛋白表达。综上，昆布散可能通过抑制甲状腺肿大大鼠氧化应激反应来改善甲状腺功能，其机制可能与调控Keap1/HO-1/NQO-1通路有关。