赵进喜教授治疗2型糖尿病的核心处方挖掘及生物学机制探讨

孙瑞茜 ，傅强 ，王逗逗 ，南赫 ，吴双 ，赵进喜

（1.北京中医药大学东直门医院肾病内分泌科，北京 100700；2.浙江中医药大学附属第二医院，杭州 310005）

糖尿病及其引发的一系列并发症严重危害着人类健康，糖尿病的防治工作面临着非常严峻的形势。糖尿病相当于中医学的消渴病，中医药治疗糖尿病具有独特的优势，越来越受到人们的关注与重视。赵进喜教授是北京中医药大学东直门医院首席专家，国家中医药管理局内分泌重点学科带头人，国医大师吕仁和教授的学术继承人，在治疗糖尿病及其并发症方面有丰富的经验和确切的疗效。本研究收集了赵进喜教授325例2型糖尿病医案，应用数据挖掘技术筛选赵进喜教授治疗2型糖尿病的核心药物配伍，针对中药具有多成分，多靶点的特点，利用网络药理学技术，筛选核心组方的主要作用成分及靶点，构建核心组方治疗疾病的靶点基因网络。对基因网络进行模块划分，并进行基因富集分析，以探索其作用机制，为进一步研究提供思路。

1 研究方法

1.1 核心处方挖掘

1.1.1 研究对象 本研究纳入赵进喜教授2017—2019年门诊及病房诊治的2型糖尿病患者病案，共纳入病案325例。

1.1.2 纳入及排除标准 纳入标准：1）年龄18～85岁，性别不限。2）符合2型糖尿病诊断标准。3）医案记录完整。排除标准：1）严重肝肾疾病。2）合并心肌梗死、心力衰竭、脑血管意外等危急重症。3）肿瘤。

1.1.3 数据处理 对药物及症状进行标准化处理，采用Microsoft office Excel 2016进行数据录入，建立病案数据库，为了方便数据统计与分析，采用二值量化法进行变量统计，“1”为“有”，“0”为“无”。

1.1.4 关联规则分析 应用Weka3.8进行药物和关联规则分析，其中支持度表示项目A和项目B同时出现的比例，置信度表示包含项目A的事物同时包含项目B的比例，提升度表示项目A和项目B的相关性。设定最小支持度为0.05，最小置信度为0.8，得到药物组合，筛选出支持度＞0.3的组合，并对药物核心组合进行网络可视化。

1.2 核心处方靶点网络的构建与分析

1.2.1 核心处方化学成分收集和筛选 使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选核心处方的化学成分。借助TCMSP平台的参数筛选活性成分，设定药物成分口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18[1]。

1.2.2 核心处方及2型糖尿病相关靶点获取 应用TCMSP平台，获取活性成分相应的靶点；应用蛋白-化合物相互作用数据库STITCH 5.0[2]，选择置信度≥0.7的靶点。取靶点的交集，建立药物靶点数据集。基于TTD数据库、DrugBank数据库、GAD数据库和DisGeNET数据库，以“Type2 Diabetes Mellitus”为关键词进行检索，筛选2型糖尿病相关靶点。

1.2.3 药物-化合物-靶点网络构建 将核心处方靶点基因和2型糖尿病相关靶标基因匹配，获得核心处方治疗2型糖尿病的潜在靶点。将靶点信息导入STRING 11.0数据库，获得靶点蛋白相互作用关系，使用 Cytoscape[3]（Version3.5.1）构建药物-化合物-靶点”关系网络及靶点相互作用网络。

1.2.4 模块划分及功能分析 将靶点导入String数据库获取蛋白相互作用关系，采用Cytoscape中的MCODE插件对靶点蛋白相互作用网络进行聚类分析，即对网络中紧密连接的靶点所形成的模块进行识别。应用Cytoscape的ClueGO插件进行富集分析（P＜0.01）。

2 研究结果

2.1 基于关联规则的核心药物组合分析 本研究共纳入325例医案，其中男159例，占48.9%，女166例，占50.9%。对325个处方进行药物频数统计，共涉及药物261味，其中使用频率最高的药物为丹参、黄芩、葛根、白芍和荔枝核。应用Weka3.8进行关联规则分析，设定最小支持度为0.05，最小置信度为0.8。在结果中筛选支持度≥0.3的组合，得到16味核心药物，为赤芍、鬼箭羽、夏枯草、白芍、半夏、陈皮、黄连、柴胡、甘草、茯苓、丹参、黄芩、葛根、地骨皮、荔枝核和仙鹤草，见图1。提升度表明关联中药之间的相关性，按提升度大小排序，得到位于前3位药物组合均为六药组合，组成为黄芩、葛根、仙鹤草、丹参、荔枝核、地骨皮，视为此次研究得到的核心药物组合，见表1。

图1 核心药物组合网络图Fig.1 Network of core drugs

表1 核心药物组合关联规则分析表Tab.1 Association rules of core drug combinations

2.2 活性成分筛选及相关靶点获得 通过TCMSP数据库检索药物化学成分，并通过OB≥30%和DL≥0.18进一步筛选出潜在活性成分，得到丹参活性成分65个，黄芩活性成分36个，葛根活性成分4个，荔枝核活性成分8个，地骨皮活性成分13个，仙鹤草活性成分5个。通过TCMSP数据库及STICH数据库获得活性成分的相关靶点，删除重复靶点，得到丹参靶点201个，黄芩靶点184个，荔枝核靶点292个，地骨皮靶点205个，仙鹤草靶点74个，葛根靶点59个。

2.3 药物-靶点-疾病网络的构建 通过DrugBank数据库、TTD数据库和DisGeNET数据库，共收集到350个2型糖尿病相关靶点。将2型糖尿病相关靶点和药物靶点相匹配，获得58个共同靶点。将中药、活性成分、靶点导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化，结果见图2。

图2 核心处方-活性成分-靶点网络图Fig.2 Core prescription-active ingredients-target network

2.4 模块划分及靶点蛋白网络构建 将靶点导入String数据库获取蛋白相互作用关系，得到靶点蛋白相互作用网络，见图3，应用Cytoscape中的MCODE插件对靶点蛋白相互作用网络进行模块识别，MCODE可以在蛋白-蛋白相互作用网络中检测密集连接区域，将每一个区域划分为一个功能模块，一共划分出5个模块，见图4。根据MCODE评分（密度×节点数）排序，评分最大为10，最小为2。

图3 靶点蛋白相互作用网络Fig.3 Network diagram of target spot-protein interaction

图4 MCODE算法划分的靶点蛋白网络模块Fig.4 Target protein network module identified by MCODE algorithm

应用Cytoscape将蛋白相互作用关系网络可视化，靶点蛋白网络共包括58个节点，以Degree（连接度）数值反映节点的大小，Degree指与该节点相关联的“边”的条数。Degree数值越大，节点越大，表明这些靶点参与可更多的生物功能，在网络中具有重要地位。将Degree值排名为前30的靶点作为核心靶点，和MCOEE划分出的功能模块相匹配，发现核心靶点集中在模块1、模块2、模块3和模块5中，见表2。

表2 核心药物组合治疗T2DM的靶点蛋白（Degree值排名前30位）Tab.2 Target protein of T2DM treated by core drug combination（Degree value ranked top 30）

2.5 核心靶点KEGG通路分析 应用Cytoscape中的ClueGO插件，对核心靶点进行KEGG通路分析，其中节点越大，表明富集的靶点越多，颜色相近表示功能相近，见图5、6。结果显示，核心靶点SLC2A2、SLC2A4和TNF富集在2型糖尿病通路（TypeⅡdiabetes mellitus）上，与其相连接的化合物为 wogonin（黄芩素）、quercetin（槲皮素）、luteolin（叶黄素）、kaempferol（山奈酚）、cryptotanshinone（隐丹参酮），可能为核心处方治疗疾病的重要活性成分。其他核心靶点主要富集在PPAR signaling pathway[LPL，PPARA，PPARG，RXRA]、Adipocytokine signaling pathway[PPARA，RXRA，SLC2A4，TNF]、Bile secretion[ABCB1，ABCB11，ABCG2，HMGCR，RXRA，SLCO1B1]、Chemicalcarcinogenesis[CYP1A1，CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，PTGS2，UGT1A1，UGT1A3，UGT1A9]等相关通路上。

图5 核心靶点KEGG通路富集分析网络图Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis for core targets

图6 核心靶点KEGG通路富集分析表Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis for core targets table

3 讨论

应用关联规则算法对325个临床医案进行分析后，得到16味核心药物，包括赤芍、鬼箭羽、夏枯草、白芍、半夏、陈皮、黄连、柴胡、甘草、茯苓、丹参、黄芩、葛根、地骨皮、荔枝核和仙鹤草。筛选其中提升度最大的药物组合，最终得到黄芩、葛根、丹参、仙鹤草、荔枝核、地骨皮等6味药物的核心组合。赵进喜教授强调消渴病“病由热生”，其基本病机为“热伤气阴”，火热炽盛，蕴结日久，日久则络脉多瘀，变生百症。因此临床在益气养阴的同时，特别强调清热治法，久病则强调化瘀通络治法，且注重解决发病过程中变生的瘀血、痰湿、气滞等病理要素[4-6]。此核心药物组合中，黄芩可清热解毒，葛根生津止渴，丹参活血祛瘀，地骨皮清肺降火，荔枝核行气止痛，仙鹤草可益气增力而不助热。既可清热、益气、生津，又可活血、行气，因此是治疗2型糖尿病的重要药物组成。在现代研究中，丹参具有抗氧化、抗心肌缺血、抗血栓、抗炎等作用机制，能够降血糖，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗[7-9]。葛根能够抗氧化、增加胰岛素敏感性，改善糖脂代谢[10]。黄芩具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、心血管保护、抗高血糖的作用[11]。地骨皮、荔枝核、仙鹤草也均有抗炎、抗氧化、降血糖的作用[12-14]。

中药具有多靶点、多途径、多环节、化学成分复杂的特点，因此其作用机制的研究常常十分困难，网络药理学利用大数据分析来进行药物研究，可以从复杂生物网络角度，对疾病机制和药物作用机制开展系统性研究[15]，因此十分适用于中药尤其是中药复方的机制探索和研究。研究发现，核心组方药物中的黄芩素、槲皮素、叶黄素、山奈酚和隐丹参酮等成分，可能为核心处方的重要活性成分，其作用的重要靶点包括SLC2A2、SLC2A4和TNF，富集在2型糖尿病通路上。SLC2A2、SLC2A4等葡萄糖转运蛋白介导血糖的内流，高血糖发生时，血糖通过SLC2A2进入肝细胞。而脂肪组织和肌肉对葡萄糖的摄取主要由SLC2A4介导，在葡萄糖的利用中起重要作用[16]，TNF-α可以通过调节胰岛素信号通路中关键调节因子的表达，促进外周组织的胰岛素抵抗，同时可作为一种独立的细胞毒素，直接作用于胰岛β细胞，导致胰岛素分不足[17-18]，因此均是糖尿病药物研发的重要靶标。此外，本次研究发现，核心组方治疗2型糖尿病的机制与脂肪因子信号通路和PPAR信号通路密切相关，相关靶点包括PPARA，PPARG等。PPAR可调控脂肪酸代谢相关基因的表达[19]，PPARA可以调节脂肪酸转运和氧化以及脂蛋白循环和胆固醇代谢，与动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病的发生发展近密切相关。PPARG信号通路是调控脂肪代谢的主要信号通路，参与脂肪代谢、葡萄糖代谢、胰岛素敏感等重要生物过程。

本研究通过数据挖掘归纳了赵进喜教授治疗2型糖尿病的核心处方，组成为黄芩、葛根、丹参、仙鹤草、荔枝核和地骨皮，其化学成分复杂，因此需通过多靶点、多途径、多环节发挥作用。黄芩素、槲皮素、叶黄素、山奈酚和隐丹参酮可能为核心处方治疗疾病的重要活性成分，其作用的重要靶点包括SLC2A2、SLC2A4、TNF，PPARA 和 PPARG 等。本研究以数据挖掘和网络药理学技术相结合的方式，从临床医案中挖掘出有效核心处方，又对其重要活性成分、作用机制等进行探索，可以为进一步的实验研究提供重要依据。