乳铁蛋白生物活性及应用进展

张 棚，张海霞，田晓静,，张福梅，曹 竑，陈士恩，马忠仁，丁功涛，宋 礼，谢瑞扎·阿里玛

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124；2.西北民族大学生物医学研究中心 中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃兰州 730030；3.西北民族大学生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州 730030；4.甘南牦牛乳研究院，甘肃合作 747000；5.马来西亚化学局 饮用水、食品和环境安全分析中心生物技术部，八打灵再也 999004）

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种天然、无害、具有多种生物活性功能的铁结合糖蛋白，由哺乳动物体内腺上皮细胞和中性粒细胞产生，广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中[1]。最早由Blanc等[2]从人乳中分离获得该蛋白，并正式命名为乳铁蛋白，被认为是铁转运和储存相关的蛋白，氨基酸序列比对分析发现该蛋白属于更广泛的乳转铁蛋白家族（Lactotransferrin）。现已知LF是相对分子质量为（76～81）×103单体蛋白，LF是该蛋白家族中铁结合能力最强的蛋白质。随着研究的深入，人们发现水解后的乳铁蛋白会产生一些具有特殊生理功能的小肽——乳铁蛋白活性多肽（LFcin B），它是牛乳铁蛋白在消化道正常生理条件下释放出的一种含25 个氨基酸残基的抗菌肽，包括5 个Trp、3 个Lys和多个芳香族氨基酸残基，具有强碱性，pH>8.15，其水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构，具有耐热、在消化道中不易降解、免疫调节作用、广谱抑菌等特性[3]。LF具有抑菌、抗病毒、抗癌、促进肠道铁的转运和吸收、抗炎症、免疫调控、促骨生长等多种生物学功能[4]，其已被广泛应用于食品、医药、化工、农业等领域，作为微生物侵入的第一道防线，其内部结构高度保守，与铁结合的专一性使铁被隔离在两个几乎相同的位置，分别位于分子的每个叶中。LF与铁结合和释放的这种特性，既是为了清除铁，也是因为其铁的状态改变了LF的结构和动力学[5]。其三维结构可以很好地解释这种能力。该分子被折叠成两个同源小叶（N-和C-小叶），每个小叶在两个结构域之间的深裂隙中结合一个单独的Fe3+离子[6]。迄今为止，LF的研究开发与应用已成为科学研究的重点，其在疾病预防、辅助治疗等方向上得到广泛应用，本文就LF的主要生理功能及其应用现状进行阐述，为下一步应用开发前景提供基础。

1 LF的生物活性

1.1 促铁转运活性

LF主要在肠道中运送铁离子，对哺乳动物从肠道中吸收铁离子起到至关重要的作用。机体对铁吸收的调节机制是负反馈调节，当细胞内缺铁时，其表面的LF受体增多，以增加LF与受体的结合[7]。

Cox等[8]将成人小肠组织切片与人LF、血清转铁蛋白和鸡卵转铁蛋白一起孵育，仅有人LF可将铁离子转移至十二指肠黏膜细胞中，由此首次发现人肠道中存在LF受体。Hiroshi等[9]利用缺铁性贫血大鼠比较了铁饱和LF与硫酸亚铁的铁吸收，大鼠每日喂食1 次饱和LF溶液1 mL，剂量为35 mg/mL，每隔14 d记录红细胞密度、比容和血红蛋白值的变化，连续70 d，喂食LF的大鼠，这些测定指标有明显增加，而硫酸亚铁组这些指标没有改善。由此发现，饱和铁LF中的铁通过肠粘膜吸收的机制不同于可溶性铁盐，LF中的铁是通过特定的LF受体跨细胞转运的，故LF促铁吸收效果显著。

1.2 抑菌活性

抗菌蛋白和肽是各生物体抵御病菌的第一道防线，大量存在于分泌液中。作为一种调理素，LF通过结合铁的能力抑制细菌的生长和生物膜的形成，进而抑制细菌粘附和进入细胞，促进细菌清除。LF除了对病原微生物必须营养物质Fe的剥夺从而抑制细菌外，还可以通过抗菌肽（LFcin）带正电荷，与带负电荷的磷脂、脂多糖亲和，增强其细胞膜的通透性，导致微生物细胞膜生理功能被彻底破坏，达到抑菌作用。

早期Wayne等[10]利用胃蛋白酶消化牛乳铁蛋白（BLF）得到一种抗菌肽，称乳铁素肽（lactoferrtin），包含原始蛋白的17～41 位氨基酸（LFcin17-30），氨基酸顺序为：Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-PheH呈碱性，其含有对抗菌活性较强的色氨酸残基[11]。荷兰的研究者发现一段包含BLF中265～284 区域的合成肽[12]（LFampin265～284）是由BLF N1 区的265～284 残基组成的多肽。这种肽的C-末端有几个阳离子基团，对多种微生物表现出抗菌活性，导致了膜电位的完全丧失，随后迅速对细菌细胞造成不可逆的损伤[13]，还有其嵌合载体（LFchiera）都有潜在的杀菌作用[14]。Sijbrandij等[15]利用该结构物对一组革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌作为生物战剂模拟物的有效能力，测定了其对灭菌效果、对细菌膜通透性和膜极性的影响，并与组成肽和天然BLF进行了比较，证明该肽相较于原始的LF具有更强的抑菌活性。

LF还可以调节肠道菌群，促进婴幼儿肠道内的双歧杆菌群的生长，抑制致病菌生长[16]。LF有抑制肠道病原体定殖和增殖的作用，促进细胞单层成分、肠道神经纤维的生长和成熟，以及提供平衡抗炎和促炎反应的信号，从而实现肠道内稳态，预防婴幼儿脓毒症和坏死性小肠结肠炎[17]。Biasibetti等[18]利用体外抑菌实验讨论了乳源抗菌剂、乳铁蛋白衍生肽、乳铁素（LFC）和乳铁蛋白（LFA）（单独或联合使用）的抗菌作用，用最小抑菌浓度和分数抑菌浓度指数两个指标评价其抗菌活性，发现其均有较强的抑菌活性，LFC单独使用抑制活性更强。

LF抗微生物功能的一个机理是它具有从潜在病原体中隔离铁的能力，但LF并不能影响所有细菌或真菌，为了克服这种铁限制，一些革兰氏阴性细菌如沙门氏菌、志贺氏菌等病原体可通过特异性识别与调控铁的排出和摄取的方式，从宿主糖蛋白中获得铁，并且可以抵御宿主防御系统[19]。LF的部分抑菌机制见表1。

表1 LF抑菌作用机制Table 1 Antimicrobial mechanism of LF

1.3 抗病毒活性

LF及其功能肽也具有抗病毒作用，包病毒或裸病毒均可以被LF和其功能肽封锁，阻止其进入细胞内。LF通过直接附着病毒颗粒或阻断其细胞受体，抑制病毒颗粒进入宿主细胞。这种活性归因于LF结合铁的能力以及它干扰宿主和病原微生物细胞受体的能力[31]。

LF可以保护宿主免受病毒感染。食用LF降低了儿童诺如病毒胃肠炎的发病率，LF通过诱导抗病毒细胞因子干扰素-α/β抑制小鼠诺如病毒的细胞粘附和病毒在细胞内的复制[32]，注射LF还可以增强自然杀伤细胞（NK细胞）活性和Th1 细胞因子反应，从而保护机体免受病毒感染。因此，摄入LF可能通过抑制病毒与细胞的附着、病毒在细胞内的复制和增强系统免疫功能来保护宿主免受病毒感染[33]。Oda等[32]研究表明LF在B细胞培养模型中可以减少人类诺如病毒的感染，抗病毒作用的机制是间接或涉及诱导先天干扰素反应。

Van等[34]临床实验证明BLF有助于老年妇女浆细胞样树突状细胞（PDC）介导的抗病毒应答，探讨了BLF、GOS和维生素D恢复PDCs和髓样DCs（MDCS）的Toll样受体（TLR）反应性和降低血清炎性标志物的潜力，在补充BLF后PDC中TLR7 介导的应答尤其增强，证实LF可以增强老年妇女PDC介导的抗病毒应答。

LF是转铁蛋白家族的一员，具有抗人乳头瘤病毒16 型（HPV-16）的活性，是防御病原微生物的重要参与者，也被证明对几种病毒有抑制性，包括疱疹病毒、腺病毒、轮状病毒和脊髓灰质炎病毒，其与LF作用机制见表2，对医学、免疫具有重要研究意义。

表2 LF抗病毒作用机制Table 2 Antiviral mechanism of LF

1.4 抗癌活性

癌症治疗分为化学药物治疗、物理疗法、生物疗法和免疫疗法。LF是先天免疫防御的铁结合糖蛋白，口服给药后LF具有较高的生物利用度、对癌细胞具有较高的选择性，且具有广泛的控制肿瘤增殖、生存、迁移、侵袭和转移的分子靶点[41]。LF通过受体介导的内吞作用进入癌细胞，增强免疫力，可作为一种优良的功能载体蛋白。

Shankaranarayanan等[42]开发了一种以BLF为载体结合阿霉素（Dox）的化疗药物，口服饱和铁BLF-Dox可抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期，降低Dox对小鼠的全身毒性、心脏毒性和神经毒性，并上调血清抗癌分子肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN-γ）、CC趋化因子4、7（CCL4、CCL17）水平。这项研究确定了一种新的、更安全的BLF-Dox结合物的应用前景，该结合物包含了一种传统的细胞毒药物和BLF蛋白，可用于靶向耐药性，可抑制肿瘤生长，具有强抗癌活性。

Antimo等[43]利用天然的铁饱和BLF抑制人胶质母细胞瘤细胞系的迁移，通过伤口愈合实验，发现BLF能够部分或完全阻止细胞迁移，这取决于它的铁饱和率。在分子水平上，BLF下调SNAIL和波形蛋白的表达，同时诱导钙粘附素水平显著升高，并抑制信号传导通路IL-6/STAT3。BLF可能是胶质母细胞瘤标准治疗方法的一种新的、有效的辅助治疗方法。

1.5 抗炎活性

通过促进初始炎症阶段，促进皮肤伤口愈合，LF表现出抗炎活性。研究表明，LF直接促进肉芽组织的形成和再上皮化[44]。LF刺激成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移，并促进细胞外基质成分的合成，如胶原和透明质酸。在伤口收缩的体外模型中，LF促进成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩，这些观察表明LF参与伤口愈合的多种生物学过程[45]。

在感染或发炎的宿主细胞中，BLF对白细胞介素-6（IL-6）具有抑制作用，从而上调铁蛋白（Fpn）、转铁蛋白受体1（TfR1）和下调铁蛋白（Ftn）的表达，后者是铁和炎症稳态（IIH）的关键因子，因此，BLF抑制细胞内铁超载，增强体内对感染以及炎症性贫血（AI）的易感性，从而重建IIH，女性在孕期受AI的影响，口服BLF可降低IL-6，增加血液学参数[46]，可预防早产。

1.6 免疫调节活性

LF是一种多功能的铁结合糖蛋白，属于天然免疫，主要与外源侵入细胞表面受体相互作用，阻止其进入宿主细胞。此外，LF既可以通过直接螯合铁，也可以通过调节主要的铁相关蛋白来发挥铁清除剂的作用[47]。BLF是一种折叠在两个对称球状小叶（N型和C型叶）中的铁结合糖蛋白，具有强大的免疫调节活性，其C叶与甲型流感病毒血凝素相互作用，可以防止机体被不同的H1 和H3 病毒亚型感染。LF与流感血凝素在低pH下的相互作用会导致血凝素构象的改变，从而抑制融合肽的活性，达到预防流感的目的。Superti等[48]研究数据更好地描述BLF对流感病毒血凝素（HA）特异的抑制活性，确认HA是药物开发的良好靶点，可以用于免疫治疗。

LF具有免疫刺激和免疫调控作用。LF大量存在于嗜中性粒细胞中[49]，是先天性免疫的重要组成部分。当革兰氏阴性菌侵入宿主时，细菌会暴露于免疫系统的多种蛋白面前，在其细胞壁中存在一种细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS），是许多噬菌体在细菌表面的吸附受体，革兰氏阴性菌释放的LPS会与多种结合分子相互作用，发挥免疫刺激作用，LF是高亲和力LPS结合的候选蛋白之一[50]。BLF与脂多糖（LPS）高亲和力结合，被认为是通过Toll样受体4（TLR4）依赖和非依赖机制发挥作用[51]，可调节人单核细胞向耐受性树突状细胞的分化，对人体胃肠道的免疫稳态有一定的调节作用。

LF还能影响巨噬细胞细胞因子的产生，促进T、B淋巴细胞和未成熟树突状细胞的成熟，增强巨噬细胞和树突状细胞刺激抗原特异性T细胞的能力[52]。

1.7 促进骨的生长活性

LF在体内影响骨的合成代谢，它在成骨细胞中具有强大的增殖和抗凋亡作用，还能抑制破骨细胞生成。因此，LF在骨生长中具有促进的生理作用，并对骨质疏松症有潜在的治疗作用[53]。

Liu等[54]采用MTT比色法检测LF对MC3T3-E1 成骨细胞增殖的影响，LF以剂量依赖性方式促进MC3T3-E1 成骨细胞增殖，即增加S期和G2/M期细胞比例。LF诱导MC3T3-E1 成骨细胞增殖是由c-Fos和c-Jun通过JNK、ERK和p38 信号通路介导的。LF作为骨组织中的成骨生长因子和治疗骨质疏松症、骨软化症疾病的治疗剂，其具有潜在的应用价值。

1.8 对真菌、寄生虫的活性

LF被认为是一种能与许多病原微生物作用的重要分子，而铁是生物体不可缺少的微量元素，参与许多重要的生命活动，微生物也需要适量的铁来生长。LF具有较高的铁结合能力，能竞争病原微生物的铁源，抵御病原微生物的侵袭，保护机体免受损伤。此外LF与微生物还有多种作用机制，如抑制微生物生物被膜的形成、抑制病毒的复制、与宿主的粘附性等。已有研究LF对部分真菌、寄生虫作用机制见表3。

表3 LF对真菌、寄生虫作用机制Table 3 Mechanism of LF action on fungi and parasites

2 乳铁蛋白的应用现状

2.1 LF在食品中的应用

2.1.1 奶粉中的应用 母乳中存在LF，特别是初乳，能为婴幼儿提供免疫和抗微生物功能。普通奶粉相较于婴幼儿配方奶粉，缺少母乳中的营养物质（LF、免疫球蛋白等）。长期食用普通奶粉会降低婴儿抵抗力、体质变弱，使得微生物的侵入相较容易，且母乳中LF可预防新生儿败血症的发生[62]。为使婴幼儿配方奶粉更接近母乳组分，在婴幼儿配方奶粉研发时，添加纯化的LF使之达到营养要求，已成必不可少的步骤。在国内，卫生部门在国家标准《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准 GB 14880-2012》[63]中批准允许在婴儿配方奶粉中添加LF的范围是≤1 g/kg。目前国内许多乳品企业，如完达山、伊利等婴幼儿配方奶粉均添加有LF，国内常见市售国产、进口幼儿配方奶粉LF添加量见表4。

表4 国内市售幼儿配方奶粉LF添加量Table 4 Addition of LF in domestic market infant formula

2.1.2 食品保藏中的应用 LF具有抑菌作用，且LF对人体无任何不良作用，所以在食品保鲜中可作为天然抑菌剂、保鲜剂。

刘琨毅等[64]利用LF协同溶菌酶制成天然复合涂膜保鲜剂，处理后牦牛肉菌落总数减少，延长了冷却牦牛肉的货架期，且不影响感官品质。付丽[65]利用LF作生物保鲜剂，探讨了乳铁蛋白最小抑菌浓度及其与其它保鲜剂对猪肉的保鲜效果，其研究表明3 mg/mL时延长冷却猪肉的货架期，维持肉色的稳定，在食品保藏应用上有良好的开发前景。刘金昉[66]以LF作复合保鲜剂原材料，结合蜂胶醇提液等对南美白对虾在贮藏过程中品质变化进行探讨，经复合保鲜剂处理后，南美白对虾在贮藏过程中货架期延长1.8 倍。故此，LF作生物保鲜剂可以抑制微生物生长，延长肉类货架期。

2.2 在化妆品中的应用

LF具有抗炎、抗菌、促进胶原蛋白形成等多种功能，且LF具有减少黑色素形成功能，故可用于化妆品、护肤品加工中的添加材料。Ishii等[67]证实了LF可作为皮肤美白剂的候选物质，抑制黑素细胞中黑色素的产生，促进胶原蛋白形成进而护肤、美白。

邢婷婷等[68]考察了LF对黑色素分泌的影响，在最大安全质量浓度为1 g/L时，LF对黑色素的抑制率可达28.39%，具有明显的美白活性；又在相同质量浓度条件下，比较了LF与熊果苷对黑色素生成的影响，LF和熊果苷对黑色素生成的抑制率分别为26.26%和12.15%，LF对黑色素表达的抑制高于功效对照原料熊果苷。因此LF具有明显的抗炎作用和美白活性，在化妆品领域有较好的应用前景。

2.3 在医药方面的应用

2.3.1 口腔治疗 口腔是一个非均匀的、特殊的环境。LF以其抑菌、杀菌、抗炎等活性，在口干症、口臭、牙槽骨或上颌骨损伤、牙龈炎、牙周炎和黑斑等不同的口腔病理中都有治疗作用。与抗生素疗法不同，LF局部给药已被证明在治疗上述所有口腔病理疾病方面都有效，没有任何不良影响[69]。Morita等[70]随机实验证明，长期含LF片剂对老人舌苔和龈上菌斑中的牙周细菌有一定的抑菌作用，减少口腔疾病的发生率，改善老年人的口腔卫生。

2.3.2 临床疾病治疗 LF及其抗菌肽具有抗菌、抗病毒和免疫调节作用，对许多病原微生物引起的感染都有很好的预防和治疗作用，LF不但能抑制微生物与宿主的结合，还能与多种抗生素协同治疗，在临床上可减少药物用量，降低抗生素或真菌抑制剂对人肝、肾功能损害。

LF多运用在肠道疾病中，LF可通过防止肠道病原体的附着来保护婴儿免受胃肠道感染[71]；补充LF可预防早产儿败血症、坏死性小肠结肠炎的发生率[72]；克罗恩结肠炎患者每天服用1 g BLF，期间没有进行任何其他治疗，2 年后，实验室血液检测显示没有疾病复发的迹象，结肠镜检查显示粘膜几乎完全愈合[73]，故LF可治疗克罗恩结肠炎。

LF还能治疗阿尔茨海默症（AD），有研究证实，LF受体在帕金森病患者脑的神经元和毛细血管内皮细胞表达量大，LF与其结合抑制朊蛋白的传播；LF通过调节p-Akt/PTEN通路影响炎症和氧化应激的关键因子，从而减轻AD的病理性级联反应和认知功能下降。LF这种作用提示其对神经退行性疾病防治的潜在应用价值[74]。

2.4 在畜牧养殖中的应用

2.4.1 动物饲料中的应用 LF作为营养强化剂添加到动物饲料中，增加饲料的营养成分，加强动物免疫能力，在饲料高温加工过程中能很好地维持其生理功能，且无毒无副作用，因此能够作为绿色饲料添加剂应用于动物的饲养。

在母猪饲料中添加LF，可使母猪发生抗炎反应时迅速获取大量内源性LF，可减少仔猪发生缺性贫血的概率，提高仔猪的免疫力和促进仔猪的生长，当仔猪发生腹泻时，LF可增强仔猪肠道对营养物质的吸收能力，并改善仔猪肠道微生物菌群从而预防腹泻。LF是铁吸收和氧化应激的重要调节因子，口服LF和铁剂联合注射是一种通过上调LFR基因表达、增强仔猪抗氧化能力和调节细胞因子活性来提高铁水平的有效方法[75]。

Esmaeili等[76]发现饲料中添加LF对黄鳍金枪鱼（Acanthopagrus latus）的体重有所增加，血清总蛋白随着饲料中LF添加量的增加而增加，每日饲料中添加LF可提高鱼的生长性能和免疫指标，提高抗哈维氏弧菌的存活率。

2.4.2 家畜疾病的防治 由于LF的抗微生物活性，对引起家畜疾病的各类致病菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等均有抑制功能，并能增强动物免疫能力。LF在家畜疾病的治疗与预防中应用也很广泛。犊牛腹泻是导致未断奶犊牛死亡最常见原因，LF降低了断奶后腹泻犊牛的死亡率。Habing等[77]探讨LF对首次诊断为腹泻的断奶犊牛的影响，研究发现，连续三天口服LF组犊牛，其死亡率降低50%；其体重与屠宰率提高、减少了疾病持续的时间。LF可成为改善治疗结果和减少抗菌剂使用的重要工具。

2.5 潜在应用

新型冠状病毒2019（COVID-19）大流行正在全球迅速蔓延。抗病毒药物和营养补充剂被认为对SARS-CoV-2（引起COVID-19 的病毒）有潜在的作用。Mirabelli等[78]发现LF是一种有效的SARSCoV-2 感染抑制剂，可以刺激抗病毒宿主细胞的反应，并在IPSC来源的肺泡上皮细胞中保留抑制活性。作为一种天然存在的无毒糖蛋白，LF已被广泛用于对抗包括SARS-CoV在内的多种病毒，与导致COVID-19 的SARS-CoV-2 密切相关。Serrano等[79]提出了LF用于COVID-19 的实验和临床理论基础，但是需要进一步的实验来验证其对病毒的抑制作用以及阐明剂量和疗效的临床试验，以确认LF对SAR-CoV-2 的预防以及COVID-19 治疗的潜力。由于目前既没有针对COVID-19 的治疗方案，也没有针对SARS-CoV-2 的预防措施，可以考虑将LF作为一种无毒的健康补充剂，也可用作COVID-19患者的辅助治疗。

3 结语与展望

LF的抑菌、抗炎、抗病毒、免疫调节、促骨生长、与铁结合能力等生物活性得到了科学的证实，且LF为天然无毒无害产物[80]，被广泛应用在食品、化工、医药、畜牧养殖等领域。随着科学进步与社会需求量增加，开发LF功能性产品迫在眉睫，结合基因工程技术改造LF，提高其抗炎、抑菌、抗病毒等能力，将其应用在生活中各个方面。重组LF研究是目前探讨的重点，LF转基因研究的最终目的是生产在生物活性、功能方面与天然LF相同或相似的重组乳铁蛋白，使之造福人类。

对LF安全性的研究，是将LF应用于其他领域的关键。通过上述LF与微生物作用研究，关于LF的应用开发力度不够，应深入研究与开发。另LF应用前景广、需求量大、天然LF的分布广，但分离纯化率低，故此，LF的高效分离纯化方法对其应用有重要意义，也是目前限制其应用的第一瓶颈。且LF原材料的开发与所分离纯化的成本限制了LF在食品、医药、畜牧、化工中应用，故此提高LF的利用率以及降低开发LF的成本成为了目前LF未被广泛应用的第二瓶颈。

人们利用LF的生物活性，开发出了功能性动物饲料、营养补充剂、复合抗生素、复合保鲜剂、辅助治疗片（剂）等，可直接作为功能性食品、药品成分、食品添加剂在各领域使用，从而达到预防侵入性疾以及加强食品功效的目的。其应用前景广阔，故此阐明LF生物活性功能及其与微生物作用机制的研究，对相关领域应用的开发具有重要意义，促进了畜牧养殖、食品和医学的相关发展。