牛肉蛋白水解及活性肽功能特性的研究进展

李希宇，杨怀谷，唐道邦,，刘忠义，王旭苹

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610；2.湘潭大学化工学院，湖南湘潭 411105）

近年来，我国居民对食品的营养需求随生活水平逐渐提升，牛肉因营养丰富、肉质鲜美，在市场中的需求量逐年增加，同时牛肉价格大幅度上涨[1]。中国成为世界第四大牛肉消费国[2]，并在2013 年由牛肉净出口国转为牛肉净进口国[3]。动物源蛋白质因其含有全部的必需氨基酸，且与植物源蛋白质相比，其氨基酸数量、比例与人体需要更接近，易被人体吸收利用，故称为“完全蛋白质”。牛肉的氨基酸组成比猪肉更接近人体需求，钙、磷、铁、锌等常量、微量元素含量丰富，还具有低脂肪、低胆固醇等优点[4−5]。

然而，对于婴幼儿和老年人、消化系统疾病患者、术后患者等需要补充优质蛋白的人群，不便于直接食用牛排等难消化的牛肉制品，可以根据特定人群的营养需求开发牛肉粉、多肽产品、氨基酸补充剂等新型牛肉制品[6]。肉类蛋白经酶解加工，大分子量、结构复杂、不利于消化的蛋白质被降解，提高了肉的营养价值、食用口感、消化利用率，进一步酶解后能够获得高经济或具备保健功能的产品，这些产品可以作为食品原料在生产中应用，这也是食品行业的主要趋势之一[7]。

目前已经从一系列肉类食材（包括牛肉、鸡肉、猪肉和水产肌肉等）中分离出具有降压、抗氧化、抗血栓和其他生物活性的多肽。一些生物活性肽还具备潜在的预防及缓解代谢综合征和心理障碍等疾病的作用[8]。但这些研究大多还处于实验室探索和验证阶段，距实际规范化生产还有较大距离。基于此，本文综合论述了牛肉蛋白的水解方法和产物，并对牛肉蛋白相关生物活性肽进行了深入讨论，展望了牛肉蛋白的高效利用发展趋势，以期为牛肉蛋白酶解工艺应用于功能性食品的开发、生产提供理论依据和参考。

1 肉类蛋白种类、含量及基本特性

肌肉中蛋白质约占肌肉总重的15%～22%，占肉中固形物的60%～88%。按照蛋白质溶解性可以将肌肉中的蛋白质分为三大类：肌浆蛋白（水溶）、肌原纤维蛋白（盐溶）和基质蛋白（不溶）[9]，它们分别约占肌肉蛋白的30%～35%、55%～60%和10%～15%，具体比例因动物种类和胴体部位而异[10]。

肌浆蛋白（sarcoplasmic proteins）是指存在于肌纤维内并可溶解于低离子强度盐溶液（<0.1 mol/L KCl）中的蛋白质，占肌肉中总蛋白质的30%～35%[11]，主要包括肌红蛋白、肌溶蛋白、肌浆酶等[12]，对肉的持水性、颜色、肉制品的风味等方面有重要影响。

肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins）是构成肌肉中肌原纤维的一种结构蛋白，在肌肉中占总蛋白质的55%～60%，主要包括肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白等[13]。肌原纤维蛋白质的功能特性主要包括：产生三维结构，通过蛋白质和蛋白质之间的相互作用形成粘弹性的凝胶基质，具备保水的能力。

基质蛋白（matrix proteins）又称为结缔组织蛋白，在肌肉中占总蛋白质的10%～15%，主要有胶原蛋白、网状蛋白和弹性蛋白，它们起到肌肉支架的作用。胶原蛋白是一种糖蛋白，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。

2 牛肉蛋白的水解方法

肉类蛋白结构致密、复杂，传统烹饪加工的肉类食物不易消化吸收。将肉类进行一定的水解处理，将大分子蛋白质水解成小分子蛋白质、多肽、氨基酸等，可以达到嫩化、增香、提升水解度、提高营养价值的效果。目前关于蛋白水解物和活性肽的研究主要集中在大豆蛋白、乳蛋白、鱼类蛋白等方面[14−16]。对牛肉蛋白水解的研究主要集中在水解条件的优化和水解度提高等方面。

通常，将蛋白质肽键裂解的方法有化学法和生物酶法两种方式。化学法又分为酸水解和碱水解。酸水解是在高温下用强酸将蛋白质完全水解。碱水解是用高温和强碱将蛋白分解。强酸水解过程中，色氨酸易被破坏；而在强碱水解过程中，尽管色氨酸相对稳定，但其他氨基酸则被不同程度破坏。相比而言，酶法水解是在较温和的条件下进行的，避免了化学法产生的不利因素和环境污染，并且不会降低蛋白质的营养价值[17−18]。牛肉的酶解方法有单酶水解、多酶复配水解以及多酶分步水解。除此之外，发酵、发酵与酶解结合、高压辅助酶解、微波辅助酶解、超声波辅助酶解等方法也在生产中被广泛应用，这些方法的组合丰富了蛋白水解的思路和途径，为产品的多样化提供了可能。

2.1 单一酶水解

单酶水解常用于对牛肉蛋白水解度初步研究，可用于水解牛肉蛋白的一般有木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等。

潘秋月等[19]对木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、AS1.398 蛋白酶四种蛋白酶水解牛肉制得的富含生物活性多肽、肉碱的混合液进行了感官评定和特性分析，发现牛肉的木瓜蛋白酶解液感官最优（水解度为20%）。徐怀德等[20]通过正交试验对比了胃蛋白酶（500～1000 U/g）和木瓜蛋白酶（1000～1500 U/g）对牛肉的水解效果，结果发现，木瓜蛋白酶（酶解后氨基态氮含量为39.4 mg/kg）比胃蛋白酶（酶解后氨基态氮含量为14.7 mg/kg）更适于牛肉酶解。

上述研究表明，从水解度、酶解液氨基酸含量、风味等方面来看，木瓜蛋白酶更适合水解牛肉蛋白。但单酶水解效果受酶解条件、酶的种类以及底物等条件的影响。单一酶水解成本低，操作简单，但也受水解度不高、产物单一、耗时长的限制，可以进一步采用多酶复配水解或多酶分步水解，也可与其他工艺结合使用，达到提高效率、提升产品质量的效果。Ma等[21]研究了木瓜蛋白酶和高压加工（highpressure processing，HPP）联合应用对牦牛肉嫩化的影响。木瓜蛋白酶单独处理，可降低牦牛肉的最大剪切力，改善持水性，却破坏了牦牛肉的颜色且耗时。当HPP与木瓜蛋白酶结合时，先加入木瓜蛋白酶处理然后进行HPP处理，成功地保持了牦牛肉的颜色，还能保证生肉的微生物安全，提高熟肉的嫩度和香气。

2.2 多酶复配水解

孟祥河等[22]采用木瓜蛋白酶（P）、碱性蛋白酶（A）两种蛋白酶复配水解牛肉，制备富含生物活性多肽、肉碱的混合液。酶解条件的优化采用响应曲面（RSM）法，确定复配酶解最佳条件：酶底物比[E]/[S]=1540（I.U/g蛋白质），酶比[EA]/[EP]=1:7.5，底物浓度[s]=3%，pH 7.0，温度T=55 ℃，水解时间t=90 min，此时水解度DH=24.67%。谭斌等[23]采用风味复合酶、复合蛋白酶（含内肽酶和外肽酶）、中性蛋白酶、碱性蛋白酶4 种酶组合水解牛肉，以水解度为指标，采用响应面分析对其酶解条件进行优化。研究表明，采用风味复合酶与复合蛋白酶复配的水解度最高，其最优化条件为：底物质量浓度4.8 g/dL，反应起始pH 7.0，温度52.5 ℃，酶解时间9 h，在此条件下达到最大水解度为50.65%。王玲玲[24]以杆菌蛋白酶复合体、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶对牛肉进行处理。研究表明，复合蛋白酶在可溶性氮、氨基酸态氮、水解度等指标上优于其他种类蛋白酶制剂。且在风味方面，其鲜味氨基酸含量明显高于其他组别，苦味氨基酸含量低于其他组别。综合评定，杆菌蛋白酶复合体是比较适宜酶解牛肉的酶制剂，木瓜蛋白酶次之。周小理等[25]采用风味复合酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶4 种酶组合水解牛肉，通过预煮、微波和超声波三种处理后的水解度为指标评价。研究表明，四种酶单一水解时水解度在5%～9%之间，采用风味复合酶与木瓜蛋白酶复配酶解后结合超声波、振荡的水解度最高，其最优化条件为：酶底物浓度比（E/S）为462414 U/g（木瓜蛋白酶:风味复合酶=4:1），底物浓度为8%，pH 4.5，温度60 ℃，酶解时间5 h，此时水解度为13.3%。

上述研究表明，多酶复配水解的效果可能优于单酶水解[25]，但多酶复合水解同时受到不同种类酶及其复配比例、酶解条件、底物浓度等更多因素的影响，为确定最佳酶解条件，需经过大量实验来确定合适的复配酶的种类和比例，研究难度较大。

2.3 多酶分步水解

闫爽等[26]用复合蛋白酶、复合蛋白酶:风味蛋白酶=2:1、木瓜蛋白酶:风味蛋白酶=2:1 三组分别进行分步酶解，其中风味蛋白酶为酶解开始2 h后再添加，研究发现3 种方式得到的水解度分别为12.29%、22.67%、25.58%。齐景凯等[27]以牛骨为原料，以水解度为指标，确定了木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶双酶分步水解牛骨的工艺条件：木瓜蛋白酶酶解工艺：酶解温度50 ℃，pH 6.5，酶解时间3 h，E/S为4000 U/g；碱性蛋白酶酶解工艺：酶解温度65 ℃，pH 8.5，酶解时间3 h，E/S为7000 U/g，此条件下水解度为25.59%。

上述研究表明，多酶分步水解的水解度也高于单酶水解，且每步水解过程为单酶水解，酶种类和酶解条件相比于多酶复配酶解更容易确定，但操作更复杂，条件改变较繁琐，耗时长。综上所述，三种酶解牛肉蛋白的方法各有其优势和缺点，应根据实际需求来选择合适的酶解方式进行研究。

2.4 其他水解方式

水解蛋白质的方法，除通过上述添加外源酶水解之外，还可以采用发酵、发酵辅助酶解、高压辅助酶解、微波辅助酶解、超声波辅助酶解等方法达到目的，见表1。发酵培养基系统本身是高度蛋白酶解系统，与蛋白酶解系统原理相同，主要利用微生物酶系将蛋白质水解[28]。高压技术旨在使蛋白质构象发生变化，暴露出新的酶的作用位点，提高蛋白质水解度和消化率[29]。微波辅助降解主要包括两方面的辅助作用，一方面是利用微波辐射热处理蛋白质；另一方面是用微波加热代替常规的水浴加热。在微波加热预处理过程中蛋白质结构变松散，暴露出更多蛋白质与酶的作用位点，促进水解反应更快更有效地进行，提高水解度[30]。超声波预处理则可以极大地改善蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等，以提高酶解效率。

表1 蛋白质的不同水解方式及其特点Table 1 Different methods of protein hydrolysis and their characteristics

2.5 酶解方式的优化

上述不同的酶解方法，要获得最优酶解条件需要使用响应面法进行优化。蛋白质水解条件的优化设计一般由筛选最适蛋白酶、单因素实验和响应面优化试验组成。酶解优化的响应面试验设计常用Box-Behnken Design（BBD）。BBD适用于2～5个因素的优化实验，每个因素取3 个水平，以（−1，0，+1）编码，其中以各试验单因素最优取值点为中心点0，+1、−1 分别是高值和低值[38]。

在酶解过程中，影响水解度及水解产物功能活性的主要因素有：酶种类、底物浓度（固液比）、酶添加量（酶底物比）、pH、酶解温度、酶解时间。在确定酶种类、比例和底物浓度的情况下，各因素对蛋白质水解度的影响程度依次是：酶添加量>酶解时间>酶解温度>初始pH[39−41]。但以不同的功能指标（水解度、抗过氧化活性、抑菌率、蛋白质回收率）为响应值，拟合得出的影响因素排序也不尽相同[42−43]。因此，实验中需根据具体实验目的来设计试验。

3 牛肉蛋白活性肽的种类及功能评价

生物活性肽（biologically active peptides，BAPs）是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，又称功能肽。它们由不同的氨基酸的种类和数量排列形成，可能还具有二级、三级结构。每一种活性肽都具有独特的组成结构，不同活性肽的组成结构决定了其功能。尽管活性肽在生物体内的含量很低，有些多肽在10−7mol/L的浓度时仍具有生理活性。生物活性肽的生物学意义主要体现在其吸收机制优于氨基酸和拥有氨基酸不具备的生理功能这两个方面[44]。

蛋白质水解既可以通过食品中的内源酶进行，也可以通过内源酶和外源酶的共同作用进行。体内外研究已广泛证实肉类衍生肽具有抗氧化、抗菌、抗血栓、类阿片类、结合矿物质、降血压等生物活性作用[45−46]。目前，已从牛肉蛋白酶解液中，分离出了呈味肽、降血压肽、抗氧化肽、抗菌肽、神经保护肽等具有生物活性的多肽。

3.1 呈味肽

呈味肽是从食品中分离或由氨基酸合成的对食品风味具有一定贡献，分子质量低于5000 u的寡肽类物质[47]。牛肉风味肽(beefy meaty peptide,BMP)是Yamasaki等[48]首次从牛肉的木瓜蛋白酶水解液中发现的一种使食物更美味的辛肽，其氨基酸序列为 Lys－Gly－Asp－Glu－Glu－Ser－Leu－Ala，分子质量为847 Da[49]，等电点为4.1。BMP具有良好的pH和热稳定性，且能稳定地存在于脂肪等复杂体系中[50]。目前，BMP已通过基因工程技术成功表达[51−52]，为BMP应用于工业化生产食品调味料提供了理论依据。

3.2 降血压肽

血管紧张素转换酶（ACE）的主要生理功能是将血管紧张素Ⅰ转化成血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩、血压升高，因此抑制ACE活性对降低血压很重要。最近几年，动物、海洋和植物来源的降血压肽是研究的热门话题[53]。

Jang等[54]从牛肉水解物中提取缬氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸（VLAQYK）序列，在口服给药自发性高血压大鼠检测实验中对收缩压有显著降低作用。Banerjee等[55]研究发现，牛跟腱胶原在细菌胶原酶水解后产生了ACE-I抑制性肽。两个生物活性肽具有竞争性ACE抑制性能，且经体外经胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶消化后，ACE抑制剂的性能仍可保持在80%。Juhui等[56]研究发现，干陈化牛肉的硬壳样品表现出明显的ACE抑制活性。上述研究表明，牛肉蛋白含有具抑制ACE活性的功能性成分，可以被广泛应用与功能性食品的开发。

3.3 抗氧化肽

目前普遍认为，生物活性肽的抗氧化机制主要是通过向自由基提供一个氢原子以及金属螯合来防止自由基生成或清除过量的自由基。在肉源性蛋白质中发现了大量的此类抗氧化肽，在动物肌肉中含量丰富，其含量受品种类型、年龄、繁殖活动和性别的影响[57]。

何梓钰等[58]采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶等5 种酶对公犊奶牛肉进行酶解，以DPPH自由基清除率为评价指标进行筛选。研究表明，中性蛋白酶为最佳的蛋白酶，最优酶解条件为加酶量0.61 g/100 mL、pH 6.80、温度54 ℃、酶解时间2.92 h，此条件下DPPH自由基清除率为91.03%。Di等[59]研究了牛胸肉肌肉中蛋白质的DPPH自由基清除能力、铁还原抗氧化能力（FRAP）和铁对蛋白质水解的抗氧化作用，并通过分子膜过滤，在3 kDa和10 kDa的滤液中分别鉴定出9 和15 个肽段。Juhui等[56]认为牛肉在干燥老化的过程中，表面的蛋白质由微生物产生的内源性酶和外源蛋白水解酶（主要）共同作用，降解产生丰富的小肽和芳香族氨基酸，因此对比新鲜、干牛肉和湿牛肉具有显著的DPPH自由基清除活性。上述研究表明，牛肉蛋白经适当条件酶解过程后，会产生具有DPPH自由基清除能力的生物活性肽，为牛肉蛋白抗氧化肽产业化生产提供了理论基础。

3.4 抗菌肽

Zasloff[60]和Lee等[61]研究表明，抗菌肽对包括细菌、真菌和病毒在内的微生物具有广谱抑制作用。在肉类蛋白中，抗菌肽主要存在于血红蛋白中。Fogaca等[62]首先从牛血红蛋白中纯化出FLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAK序列，该序列对革兰氏阳性菌和真菌菌株具有良好的抑制活性。Hu等[63]从牛血红蛋白中心部位新纯化出VNFK LLSHSLLVTLASHL序列，对大肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌活性。Jang等[64]发现，除牛血红蛋白外，牛肉肌浆蛋白还被发现含有降压作用的抗菌肽GFHI、DFHING、FHG和GLSDGEWQ序列。

哺乳动物源的天然抗菌肽具有来源广泛、含量丰富、安全性高、抗菌谱广等优点，为开发新型抗生素提供了新的方向，将会在医药工业上有广阔的应用前景。

3.5 神经保护肽

神经保护剂的作用机制包括抑制细胞变性、炎症和NO的产生，清除自由基，阻断导致凋亡的途径[65]。虽然肽作为神经保护的药物肽，通过血脑屏障（BBB）的渗透能力是有限的，一些研究已经证明了预防神经退行性疾病和抗氧化活性之间的密切联系[66]。

Lee等[67]利用碱性-AK酶从牛肉肌原纤维蛋白中提取出两种3 kDa肽组分（AK3KF1和AK3KF2），并对其对人神经细胞（SH-SY5Y）抗H2O2诱导细胞凋亡的保护作用进行了研究。结果表明肽组分（AK3KF1）可以预防神经元细胞死亡，并可能有助于预防神经退行性疾病。Lee等[68]又用商业酶（alkaline-AK和木瓜蛋白酶）从牛肉酶解液中提取到<3 kDa和<10 kDa肽段的不同分子量肽，具有较好的神经保护活性和抗氧化活性。在H2O2处理的SH-SY5Y细胞中，细胞凋亡率降低了20.06%至33.25%。此外，alkaline-AK和木瓜蛋白酶制备的肽段无细胞毒性。以上研究表明，利用牛肉和廉价商业肽生产低成本神经保护肽，是牛肉蛋白酶解生产生物活性肽的新方向，将来可用于开发有助于缓解神经退行性疾病的保健品。

4 牛肉水解肽的高效利用和发展趋势

通过使用特定的蛋白酶水解牛肉蛋白质，可以改变牛肉的营养特性，包括改善消化率、改变感官品质（如质地、味道）、提高抗氧化能力等，从而实现人们希望的食品加工所带来的诸多积极效果。此外，许多生物活性肽基于其结构性质可以发挥多功能特性，在功能保健食品的生产中有更广泛的应用。

Back等[69]以牛肉水解液为原料，研制了具有降血压作用的天然调味品。牛肉水解液的最佳水解条件为碱性酶（产品名：Alcalase 2.4L，Novozyme，丹麦）加酶量1%、牛肉浓度5%、水解4 h。同条件下，牛肉水解液的ACE抑制活性比对照提高70.2%。用15%牛肉水解液调味料的ACE抑制活性与对照相比，增加了41.7%，可能具有降血压作用。Zhang等[70]发现，牛肉蛋白脂肪酶水解物（BPAH）和糜蛋白酶水解物（BPCH）与葡萄糖反应，生成的BPAH-AGES和BPCH-AGES，能显著降低奎宁的苦味强度，可以作为苦味阻滞剂。

除生物保健作用外，近年来，关于生物活性肽在医药领域的研究也越来越深入，涵盖了从陆地生物到海洋生物的各种多肽药物的研发。这些活性肽相关功能的研究可以参照化学药物的思路和模式，即：疾病对象和靶点的确定；多肽的产生、分离鉴定、功能预测（生物信息分析或计算机模拟）和生物验证（细胞模型试验、动物模型试验）、生物安全性分析等，如图1 所示[71]。

图1 药物或活性肽的一般研发策略和过程Fig.1 Schematic of the workflow commonly used in drug or active peptides discovery

由于食品衍生肽的蛋白质和前体物是天然的，以及受到人体的良好耐受，因此它们在药物开发中的应用可能降低研发过程中毒理学研究的成本和持续时间[72]。然而，生物活性肽的代谢稳定性较差，所以将其转化为药物是一个挑战。分子接枝是一种将生物活性肽序列融合到合适的分子支架，从而稳定和约束肽的方法，不仅提高了活性肽先导的稳定性，而且具有扩展其功能的潜力。分子接枝已经成功地用于改进肽药物的先导稳定性，增强构象刚性，促进细胞内靶点的传递，并在某些情况下提高口服的疗效[73]。尽管目前分子嫁接的应用主要集中在治疗上，例如：疼痛、代谢性疾病和癌症，但它在未来将有更为广泛的潜在用途。

综上所述，利用牛肉蛋白酶解产物生产功能性调味品、苦味阻滞剂等，将肉类生物活性肽和分子接枝技术结合，生产接枝肽药物，都是牛肉蛋白高效利用的发展方向。目前已经投放市场的肽类功能性产品主要来源于植物、牛奶和水产品等，肉类衍生肽的应用较少，大多还处于试验阶段，且大部分生物活性仅限于体外评估，不足以解释其在人体吸收后的生物活性作用。此外，缺乏大规模的筛选和纯化手段也是生物活性肽实际生产中的一大挑战。尽管存在以上诸多技术难题，考虑到牛肉蛋白具有原料广泛、成分丰富、营养价值高、安全性高等优势，系统性开展相关研发课题具有很大的基础科研和成果转化价值，其衍生肽的应用将在保健食品、动物饲料、乃至化妆品等行业中显现出巨大的市场潜力。

5 结语

牛肉经过外源酶的单酶水解、多酶复配水解、多酶分步水解以及其他技术结合水解等方式，制备的牛肉水解液富含多种氨基酸和生物活性肽，并保留了牛肉中大部分的其他营养物质，可作为优质的营养补充剂。人们已在牛肉蛋白酶解产物中鉴定出许多生物活性肽，具有抗氧化、降血压、抗菌、保护神经细胞等多种生理活性。这些不同的功能活性，加上来源的安全性，同时考虑到实际经济成本，使牛肉衍生的生物活性肽在食品基料、食品保健或医药研发等领域有非常广阔的应用前景。进一步在动物体内和人体中验证这些肽类的功能和效率、创造高效且大规模的生产工艺、完善标准化监管体系等，将是牛肉蛋白高效利用和商业化开发在未来的主要研究方向。