基于网络药理学分析金钗石斛治疗神经系统疾病的药效物质基础及作用机制

段灿灿，王清纯，赵泽粉，蔡秋雪，刘 方，晏仁义，何天目，王雅芝，李桂琳，张建永,

（1.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州遵义 563003；2.遵义医科大学药学院，贵州遵义 563009；3.双鹤药业（海南）有限责任公司，海南海口 570311；4.云南省德宏热带农业科学研究所，云南瑞丽 678600）

神经系统疾病包括神经退行性疾病、神经自身免疫病、神经系统感染等在内的一组系统性疾病[1]。随着社会的老龄化严重，神经系统疾病已成为导致人类死亡和残疾的主要原因之一。据调查，截止到2017 年5 月，全球约4700 万阿尔兹海默症患者，预计到2030 年，将达到7470 万[2]。目前临床治疗神经系统疾病药物虽然较多，但是药物会造成一定的不良反应，如心理状态异常、支气管痉挛和血管性水肿等[3]。特别是阿尔茨海默病等神经退行性疾病目前仍无较理想的药物可用，因此研发新的神经系统疾病药物具有重要意义。

金钗石斛（Dendrobium nobileLindl）为兰科植物金钗石斛的茎，因形像古代头上的发钗而得名。主产广西、贵州等地，具滋阴清热，生津止渴等功效。目前从金钗石斛中已经分离到了生物碱、酚类、黄酮类、等生物活性成分[4]。现代药理学发现，金钗石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强免疫、改善记忆及抗白内障等多种药理活性[5]。如金钗石斛提取物能有效改善小鼠抑郁模型的行为学表现，提高小鼠脑内的多巴胺和5-羟色胺水平[6]；金钗石斛可以通过提高超氧化物歧化酶水平及降低过氧化脂质含量达到提高记忆的效果[7]；金钗石斛生物总碱对脂多糖诱导大鼠海马tau蛋白的高度磷酸化和炎症等具有明显的改善作用，同时可减轻海马周围神经细胞的凋亡[8]；金钗石斛多糖可保护神经元免受炎症因子的毒性作用，通过拮抗脂多糖对胶质细胞-神经元混合培养体系，降低炎症因子表达及抑制小胶质细胞激活等机制[9−11]。因此，金钗石斛在治疗神经系统疾病中具有很大的潜力，亟需深入挖掘金钗石斛治疗神经系统疾病的活性成分和作用靶点，厘清金钗石斛治疗神经系统疾病的潜在治疗靶点及分子机制。

由于中药多成分-多靶点-多通路的特点，难以厘清其具体治病机制。网络药理学是由系统生物学及多向药理学等多学科的交叉融合，运用基因组学、代谢组学、可视化和分子对接等多种技术，揭示“化合物-基因-通路-疾病”之间复杂的网络关系，多维度分析疾病的致病基础，探索药物干预后的药理学机制，并通过相应的实验来验证、评估药物的有效性、作用机制及不良反应，从而发现高效、低毒的药物[12]。如有研究基于网络药理学的方法，探讨了二至丸预防阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）的物质基础和机制，发现了二至丸治疗AD的有效成分可能是槲皮素、香叶醇、β-谷甾醇、橙花醇和厄立地黄，其作用机制可能与Wnt、MAPK和PI3K-AKT-M Tor三种信号途径有关[13]。有研究基于中药网络药理学的方法，分析得出四逆散可以通过调节G蛋白偶联受体蛋白信号通路、cAMP系统神经系统、神经递质分泌等途径发挥抗抑郁作用[14]。故本研究基于网络药理学探索金钗石斛治疗神经系统疾病的分子机制，以期为后续深入研究其药效物质基础及治疗机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）；PubChem数据库；Chemical Book数据库；ADMETlab数据库；Swiss Target Prediction数据库；TargetNet数据库；UniProt数据库；比较毒理基因组学数据库（CTD）；功能关联蛋白网络数据库（STRING）；生物学信息注释数据库（DAVID）；AutoDock Vina软件；ChemBioDraw 13.0 软件；Cytoscape 3.6.1软件。

1.2 实验方法

1.2.1 金钗石斛化学成分的收集 检索国内外文献数据库，包括中国知网、万方、数据库SinoMed (http://www.sinomed.ac.cn)、Pubmed (http://pubmed.com.cutestat.com)和TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[15−16]，得到金钗石斛中的活性成分。再利 用 Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、Chemical Book（http://www.chemicalbook.com）和ADMETlab (http://admet.scbdd.com)数据库等平台验证其成分结构，并采用ChemBioDraw13.0 软件绘制其分子结构，保存为“sdf”文件。

1.2.2 金钗石斛成分潜在靶点预测 采用TargetNet(http://targetnet.scbdd.com) 在线数据库预测成分的潜在靶点，以准确性（Accuracy，AUC）≥0.7 为遴选条件，其中AUC代表采用模型方法的预测准确率，筛选Uniprot_ID、Protein、Prob（>0.9）等靶点的作用的潜在靶点群，同时本研究是针对人体，故再利用Uniprot (http://www.uniprot.org)数据库筛选人源的潜在靶点。

1.2.3 金钗石斛成分-靶点互作网络 采用Cytoscape 3.6.1 软件，构建金钗石斛“成分-靶点”网络，运用Network analysis插件分析网络特征指标度（degree）和介数（Betweenness），获取主要药效物质基础和关键靶点。

1.2.4 靶点-疾病互作网络 将靶点导入CTD数据库（https://ctdbase.org/tools/batchQuery.go）进行相关疾病的分析，剔除非神经系统疾病的靶点。采用Cytoscape 3.6.1 软件，构建“靶点-疾病”互作网络，进一步以Network analysis插件对网络的Degree和Betweenness进行分析。同时根据人类孟德尔遗传数据库（http://www.omim.org）对不同类别疾病归纳和分类。

1.2.5 作用靶点的PPI网络 将获取的相关神经系统疾病靶点进行整合，采用STRING (https://stringdb.org)数据库在线分析，获取靶点之间的相互作用数据，导入Cytoscape 3.6.1 软件，重新构建金钗石斛潜在作用靶点的PPI网络，利用Analyze network工具对网络进行分析，采用gnoyiacGenerate style from statistics工具根据degree值的大小对靶点的大小和颜色进行变换。

1.2.6 靶点蛋白的基因功能和通路分析 本研究采用在线分析数据库DAVID（https://david.ncifcrf.gov）对金钗石斛作用的靶点进行富集分析，基于ClueGO插件进行基因功能及KEGG通路富集分析。设定阈值P-value<0.05，筛选主要靶点信号通路。并使用Omicshare（http://www.omicshare.com/tools/index.php/Home/Soft/trend）在线分析平台对富集分析结果进行可视化，进一步整合探析金钗石斛治疗神经系统疾病的主要信号通路，揭示金钗石斛治疗神经系统疾病的潜在分子机制。

1.2.7 分子对接 选择成分-靶点网络中degree排名前6 的靶点，同时选择金钗石斛degree排名前10 的成分，采用AutoDock Vina软件，将靶点与成分进行分子对接验证，以其结合能（Binding energy）评价化合物和靶点的结合活性。一般认为结合能越高，配体与受体的结合性越稳定。当结合能大于5.0，表明化合物靶点结合具有较好的结合活性。首先通过RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）数据库获取靶点蛋白晶体结构，用OpenBabel软件将成分的化学结构SDF格式转化为PDB格式。使用AutoDock Vina得到对接活性位点、结合能和均方根偏差(RMSD)。最后运用Pymol软件对对接结果进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 金钗石斛目标化合物的筛选

本研究通过检索中国知网、万方、数据库SinoMed(http://www.sinomed.ac.cn)、Pubmed (http://pubmed.com.cutestat.com)和TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中报道的金钗石斛化学成分，共收集到47 个（表1）。

表1 金钗石斛中的化学成分信息Table 1 Chemical constituents of Dendrobium nobile

2.2 金钗石斛成分-靶点网络构建与分析

如图1 所示，金钗石斛“成分-靶点”网络得到135 个节点，其中47 个为化合物成分，88 个为预测靶点。它们由946 条边相连构成一个完整的网络，边代表化合物和靶点的相互作用关系，度值平均值为7，其中度值排名前6 的成分是Nobilin D（果香菊素D，degree=42）、Nobliomethylene（-，degree=38）、decumbic acid B（癸二酸B，degree=33）、(+)-dendrolactone（(+)-树内酯，degree=32）、(−)-denobilone A（(−)-二苯酮A，degree=30）和 Nobilin（果香菊素，degree=30），度值排名前6 个靶点分别是巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）、雌激素受体 2（ERS2）、芳香化酶（CYP19A1）、人乳腺癌抵抗蛋白（ABCG1）、Toll样受体9（TLR9）、多巴胺受体-D5 抗原（DRD5），degree分别为37、37、35、33、32、32。

图1 金钗石斛成分-靶点网络图Fig.1 Composition target network of Dendrobium nobile

2.3 靶点-疾病网络分析

将靶点蛋白导入CTD数据库中进行相关疾病的分析，查询靶点关联的疾病，删除重复项后，列取前20 种疾病名称及疾病分类，如表2 所示。再采用Cytoscape 3.6.1 软件，构建“靶点-疾病”网络，如图2所示。

图2 金钗石斛靶点-疾病网络图Fig.2 Target disease network of Dendrobium nobile

表2 金钗石斛前20 个潜在作用靶点疾病名称及疾病分类Table 2 Disease names and disease classification of the first 20 potential targets of Dendrobium nobile

2.4 金钗石斛作用靶点蛋白相互作用网络构建与分析

对金钗石斛成分的潜在作用靶点进行合并整合，同时删除重复的作用靶点，总共得到88 个靶点蛋白，进一步导入STRING数据库中在线分析，限定人源物种，获取88 个靶点的相互蛋白作用关系，将结果整合后导入Cytoscape 3.6.1 软件构建蛋白质相互作用（PPI）网络图，如图3 所示。PPI网络共包括84 个节点，1338 条边，每一个节点表示一个靶点蛋白，节点越大、颜色越红，正方形越大，其degree值变大；边表示蛋白之间的关联。根据网络拓扑学性质，获得 degree值排前 10 的关键蛋白分别为APP（degree=38）、SRC（degree=36）、CASP3（degree=34）、DRD2（degree=34）、TNF（degree=33）、PTGS2（degree=32）、OPRM1（degree=31）、CNR1（degree=31）、ADRA2A（degree=31）、HTR1A（degree=30），表明这些靶点蛋白在PPI网络图中的中心度较高，能与多个蛋白发生相互作用，提示其可能是金钗石斛作用的重要靶点。

图3 金钗石斛潜在作用靶点的PPI网络图Fig.3 PPI network of potential targets of Dendrobium nobile

2.5 GO(Gene ontology)生物进程分析

将金钗石斛作用的88 个靶点进行GO生物进程分析，得到生物进程层级关系（如图4 所示），共有759 个生物进程，其中排名前10 的生物进程（表3），主要涉及细胞对药物的反应、痛觉、对雌二醇的反应、肽酰苏氨酸磷酸化、阿片受体信号通路、慢性炎症反应等方面，提示金钗石斛可能调控以上生物进程来治疗神经系统疾病。

图4 靶点的GO生物进程层级关系Fig.4 The hierarchy of go biological process of target

表3 金钗石斛治疗神经系统疾病靶点的生物进程分析结果Table 3 Biological process analysis results of Dendrobium nobile in the treatment of nervous system diseases

2.6 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析

采用DAVID在线分析平台对金钗石斛作用的88 个靶点进行KEGG通路富集分析，结果如图5 所示。KEGG的富集程度主要通过影响因子（Rich factor，RF）、P值及参与调控通路上的基因个数进行综合分析，其中RF指差异表达的基因中位于该通路条目的基因数目与所有注释基因中位于该通路条目的目的基因总数的比值，富集的程度随RF大小变化。对结果整合分析发现靶点主要富集于Sphingolipid signaling pathway、Cocaine addiction以及Serotonergic synapse这三条信号通路。

图5 前20 个KEGG通路富集气泡图（P<0.05）Fig.5 Enrichment bubble diagram of the first 20 KEGG pathways (P<0.05)

2.7 分子对接验证

为验证金钗石斛成分预测靶点的准确性，本研究采用AutoDock Vina软件对11 个degree较大的成分和6 个靶点根据默认参数进行分子对接，以结合能（Binding energy）作为筛选条件，结合能越小表明对接结果越好。对于多构象的对接结果，筛选出结合能最低的对接构象，如表4 所示。大部分化合物与分子靶点对接结合能绝对值大于5.0，表明分子对接结果良好，验证了网络构建预测的准确性。运用Pymol软件，根据结合能的大小选出每个靶点蛋白对接最好的化合物进行可视化分析，结果如图6 所示，其中ESR2 与化合物C25、MIF与化合物C42、CYP19A1 与化合物C32 均可以形成氢键。实验结果为进一步整合探析金钗石斛的药效物质提供理论参考。

表4 金钗石斛作用的4 个靶点与11 个成分的分子对接得分Table 4 Molecular docking scores of 4 targets and 11 components of Dendrobium nobile

图6 ESR2、MIF、ABCG2、CYP19A1 与化合物结合能最低的最佳对接构象Fig.6 The best docking conformation of ESR2,MIF,ABCG2,CYP19A1 and the compounds with the lowest binding energy

3 讨论与结论

石斛作为药用始见于《神农本草经》，金钗石斛是药用石斛主流品种之一，具有益胃生津、滋阴清热的功效[17−18]。有研究发现金钗石斛叶总黄酮具有较好的抗氧化、抑制Aβ42 蛋白聚集及螯合金属离子的能力，体外具有抗AD活性[19]；金钗石斛总碱对APP/PS1 转基因小鼠空间学习记忆能力具有改善作用[20]。然而其具体作用机制尚不清楚，因此，本研究采用网络药理学接和分子对接整合分析。

本研究通过构建多元生物网络，筛选到金钗石斛活性成分47 个，作用靶点88 个，富集疾病多与帕金森、阿尔茨海默症及精神、记忆障碍等神经系统疾病有关，可能与鞘脂信号通路和5-羟色胺突触有关。根据degree的大小，成分-靶点网络分析发现金钗石斛发挥作用来源的主要活性成分有Nobilin D（degree=42）、Nobliomethylene（degree=38 ）、decumbic acid B（degree=33）、（+）-dendrolactone（degree=32）、（−）-denobilone A（degree=30）和 Nobilin（degree=30）。表明这些成分可能是金钗石斛发挥治疗神经系统疾病的主要药效物质基础。上述成分的实验药理学结果也进一步佐证了预测，其中有研究发现Nobliomethylene可显著增加猫免疫缺陷病毒模型诱导的中枢神经系统功能病理变化，如脑干听觉诱发电位延迟[21]。但其他Nobilin D、decumbic acid B、（+）-dendrolactone、（−）-denobilone A、Nobilin的相关活性尚不清楚，亟需对其潜在靶点进一步验证分析。进一步探寻这些化合物的靶点发现，根据网络分析可知，金钗石斛这些成分作用的核心靶点包括MIF（degree=37）、ERS2（degree=37）、CYP19A1（degree=35）、ABCG2（degree=33）、TLR9（degree=32）、DRD5（degree=32）等。目前，关于以上主要活性成分作用于核心靶点的研究的文献报道较少，但分子对接结果显示，MIF、ERS2、CYP19A1D等核心靶点能够与Nobliomethylene、decumbic acid B、（−）-denobilone A等主要活性成分较好对接，因此，对金钗石斛中的活性化合物及作用机制值得进一步深入研究。

多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种进行性免疫介导的中枢神经系统脱髓鞘疾病。随着时间的推移，中枢神经系统内炎症和神经退行性通路的慢性激活会导致永久性神经功能障碍的累积。MIF是一种多功能细胞因子，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Allergic Encephalomyelitis,EAE）的MS小鼠模型中，发现MIF在调节炎症病理发展中枢神经系统效应器机制中起关键作用。在MS脑组织的检查中，发现MIF在活跃炎症区域高度表达，提示MIF可能对中枢神经系统炎症反应有深远的影响。这些研究说明了MIF在EAE期间促进中枢神经系统巨噬细胞活化和募集的能力：这两种中枢神经系统效应器机制对EAE进展至关重要。MIF对小胶质细胞具有有效的促炎作用，并使与中枢神经系统自身免疫介导的组织损伤相关的促炎基因表达谱极化[22−24]。有研究发现AD女性受试者中ESR2 等位基因（s4986938,rs867443）对AD具有显著的保护作用，相反CYP19A1 的G等位基因（rs11638442,rs11632698）可能提升AD的发病风险[22]。有研究发现ABCG2 在人体脑内皮组织高表达，提示其可能与多种神经系统疾病相关[25]。有研究发现EAE小鼠的发育过程中，TLR9 在中枢神经系统中高表达，且与EAE发展有关[26]。有研究发现，树突状细胞的DRD5 受刺激后可增强炎症，加速EAE的进展，进一步研究发现EAE小鼠树突状细胞中的DRD5 缺乏可导致中枢神经系统具有炎症潜能的CD4+T细胞亚群的频率降低[27]。综上可知，金钗石斛可通过多靶点治疗神经系统疾病。此外，通过“化合物-靶点”网络和“靶点-疾病”网络整合分析，为后期在各类型神经系统疾病的研究中，选取具有潜力的活性化合物及靶点进行研究，可进一步有效揭示其分子机制。

本研究基于在线分析系统DAVID进行通路富集分析发现，核心靶点主要与3 个通路Sphingolipid signaling pathway、Cocaine addiction以及Serotonergic synapse有关。其中，可卡因通过阻断多巴胺转运蛋白并抑制多巴胺再摄取，从而导致突触间隙中多巴胺持续作用于DRD1、DRD5 等相应受体，诱发Cocaine addiction[28]，而核心靶点TLR9 激动剂可拮抗可卡因成瘾，并能阻止运动过度效应[29]。核心靶点ABCG2 是重要的ABC转运蛋白，可通过靶向脑毛细血管内皮细胞内Sphingolipid signaling pathway向P-糖蛋白的信号转导，提高CNS药物治疗疗效[30]。核心靶点MIF和IL-6 等细胞因子可透过受损的血脑屏障，影响多巴胺、五羟色胺和去甲肾上腺素等神经递质的代谢，引发中枢神经系统内的炎性反应[31−33]。

有研究报道AD患者存在Sphingolipid代谢异常，进一步分析发现淀粉样β沉积可能促使酸性鞘磷脂酶激活，提示Sphingolipid signaling pathway参与Sphingolipid代谢异常可能AD的发病机制[34]。有研究发现Cocaine addiction患者出现包括注意力、学习、记忆等多种中枢神经系统功能异常，提示Cocaine addiction通路可能参与了Cocaine引起的神经毒性[35]。进一步研究发现Cocaine反复使用会导致神经系统生理学和结构的永久性改变，引起精神疾病[36]。有研究发现Serotonergic synapse通路的一些多功能调节剂具有神经保护、抗炎等潜力，且一种对Serotonergic synapse和多巴胺受体具有高度亲和力的血清素转运体抑制剂-Lumateperone已经在痴呆、双相抑郁疾病上进行临床试验[37]。

综上所述，本研究基于整合网络药理学研究方法，通过“成分-靶点”网络、“靶点-疾病”网络及KEGG通路富集分析等一系列整合网络分析，从系统层面揭示金钗石斛治疗神经系统疾病的药效物质基础及分子机制。但由于网络预测的局限性，仍需进一步实验对其关键成分及靶点进行验证，为后续深入研究金钗石斛治疗神经系统疾病的药效物质基础及分子机制提供参考。