科研与教学相结合的《细胞生物学实验》教学模式探究——以荧光标记的细胞融合实验为例 *

成希飞 方廖琼

(1. 西南大学教务处，重庆 400715; 2. 西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院，重庆 400715)

随着中国高等教育迅速发展，教育教学改革不断深化，培养本科生的科研能力已成为强化素质教育和深化高等教育改革的一项重要内容[1]。教育部《关于一流本科课程建设的实施意见》中指出：一流本科课程教学内容要体现前沿性与时代性，及时将学术研究、科技发展前沿成果引入课程。细胞生物学作为生物科学中发展最快的一门尖端学科，是生物、农学、医学等相关专业学生的学科必修课程，该门课程又包括理论与实验两部分，其中《细胞生物学实验》课程要求学生具有较好的实际操作与严谨思维能力[2]。越来越多的生物、农学、医学专业的学生在完成本科学习之后进入研究生阶段深造学习，在研究生学习阶段细胞生物学相关的实验技能又是必需掌握的基础实验技能之一。这就需要在本科阶段的《细胞生物学实验》课程教育中更加注重学生创新能力的培养，加强学生科研思维能力及实验技能的训练。

传统的细胞生物学实验往往由于课时的限制，偏重于基础性、验证性实验。为了提升本科生对《细胞生物学实验》课程的学习成效，部分高校进行了实验教学改革，取得了良好的效果[3-6]，在很大程度上改善了原来教学内容老旧、无连贯性以及以操作简单的验证实验为主等问题。本校生物技术专业的《细胞生物学实验》课程同样受到了越来越多的关注和重视，课程学时逐渐增多。从2014级开始，《细胞生物学实验》课程学时由之前的18个学时增加至27个学时，内容包括细胞大小的测定及计数、荧光显微镜及相差显微镜的使用、细胞器的分离及观察、细胞化学、细胞膜通透性的观察、细胞骨架的观察、细胞传代培养及周期观察、细胞融合共8项实验。在最新制定的2018级实验教学大纲中，《细胞生物学实验》课程学时由27个学时增加至40个学时，对课程内容也做出了相应的调整，增加了开放性、综合性实验；在原有实验内容的基础上增加了细胞冻存及复苏、MTT法测定细胞活力实验，并且对细胞融合实验方法做了改进，改为荧光标记的细胞融合观察。新的《细胞生物学实验》教学大纲中还增加了细胞传代培养及周期观察实验的学时数，要求学生能够熟练掌握细胞培养技术，并且在细胞培养过程中完成MTT法测定细胞活力及荧光标记的细胞融合实验，将相关实验融合成为一个互相关联的设计性、开放性实验，目的是增强学生的学习兴趣及动手能力，同时也增强学生的实验设计及查阅相关科技文献的能力。

本文以荧光标记的细胞融合实验为例，阐述对实验课程的设计与方法进行改进的重要性。现有《细胞生物学实验》教材中细胞融合实验多以鸡血红细胞为实验材料[7]，采用不同技术手段(主要包括PEG法、电击法等)[8]诱导细胞融合，通过普通生物显微镜观察细胞形态判断细胞是否发生融合。以荧光标记的细胞融合实验将小鼠淋巴瘤细胞(Yac-1)作为实验材料，在原有细胞融合实验技术基础上进行的改进如下：通过采用DiO和DiI两种荧光探针分别标记细胞，DiO标记的细胞膜只在蓝色激发光下发出绿色荧光，DiI标记的细胞膜只在绿色激发光下发出红色荧光；采用PEG4000溶液诱导Yac-1细胞进行融合，并用DAPI荧光染料标记细胞核。采用荧光显微镜进行观察，融合了的细胞膜会发出被DiO和DiI标记产生2种颜色的荧光，细胞核通过DAPI染色后会发出蓝紫色荧光。以荧光标记的细胞融合实验方法新颖，不仅更加利于对细胞是否发生融合进行观察，而且有利于启发学生的科研思维和增强其实验操作能力。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验材料为小鼠淋巴瘤细胞Yac-1细胞株，由西南大学生命科学实验教学中心保存。

1.2 主要试剂和仪器

PEG4000(重庆川东化工有限公司)，1640培养基(上海ExCell公司)，胎牛血清、双抗、Hanks液(带离子)、DiO、DiI、DAPI均购自上海碧云天生物技术有限公司。

水浴锅(上海柏欣仪器设备厂)，3111二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，BK-FL荧光显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞标记

参照文献[9]的方法。选择生长状态良好的Yac-1细胞，取0.5 mL细胞悬液(106个/mL左右)于2根离心管中，使用低速离心机1 000×g离心10 min，弃去上清液。加入0.5 mL完全培养基(10%胎牛血清及1%双抗)，充分吹打重悬细胞，1 000×g离心10 min，弃去上清液，重复1次，充分洗净细胞。分别在2根离心管中加入40 μL DiO或DiI(60 μmol/L，使用DMSO配制)，放入37 ℃培养箱中保温30 min。

1.3.2 细胞融合

用Hanks液配制质量分数为40%～50%的PEG溶液1 mL，放入37 ℃水浴锅中备用。将标记好的细胞悬液1 000×g离心5 min，弃去上清，2管中分别加入5 mL Hanks液，用吸管将细胞吹散，混匀2管细胞，然后1 000×g离心5 min，弃去上清，剩余液体1 mL左右，用吸管缓慢地将细胞团块吹散。取预热的PEG溶液1 mL，在1 min内滴加到细胞悬液中，注意控制时间，滴加速度不可过快或过慢，边滴加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置3 min。缓慢滴加10 mL Hanks液以终止PEG的作用，在37 ℃水浴内静置5 min。离心弃上清，剩余2 mL左右液体，混匀后制备装片，再加入5 μL DAPI染料，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

在细胞融合之前，用DiO标记的Yac-1细胞的细胞膜在蓝光下会发出绿色荧光，DiI标记的细胞膜会在绿光下发出红色荧光。细胞融合成功之后，融合的细胞会同时发出绿色荧光和红色荧光，经DAPI标记后，细胞核会发出蓝紫色荧光(图1)。由图1-A和B可以明显地看出，只有细胞膜既能发出绿色荧光，又能发出红色荧光的细胞为融合细胞。如图1-A、C左下方的3个细胞，细胞核具有蓝紫色荧光而细胞膜只能发出绿色荧光，而在图1-B中未显示，说明此3个细胞为未融合细胞。

图1 荧光显微镜下观察到小鼠淋巴瘤细胞(Yac-1)间的融合

3 讨 论

3.1 对实验方法进行改进的益处

传统细胞融合的观察方法有较大的局限性：采用普通生物显微镜对细胞进行观察，紧挨着的2个细胞无法判断到底是发生融合还是由于细胞分散不好形成的细胞团块，这就会造成融合率计算不准确，并且细胞核是否融合也不容易被观察到。改进后实验方法较原来相比有了明显进步，用荧光显微镜可观察到融合的细胞会在蓝光与绿光下同时发出绿色和红色荧光，而且通过对细胞核的荧光标记对比融合的细胞核体积会有所增大，因此用改进的实验方法可以帮助学生更加清晰、准确地观察细胞融合的过程。此外，用改进的实验方法在实验前还要求学生查阅科研文献，了解细胞融合所需PEG溶液的浓度以及滴加PEG溶液的时间等实验条件，并且要求学生在一定范围内按照参考文献的结果来优化设置拟开展实验的条件。这样的施教方式既锻炼了学生查阅科研文献的能力，又增强了学生学习的主动性，改变了学生以往只是按照老师设置的实验条件进行验证实验操作的被动学习方法，真正达到了实验课程的教学目的。

3.2 实验教学过程中的注意事项

细胞的状态对细胞融合的影响很大，所以荧光标记细胞融合实验使用的细胞要处于生长旺盛期，且生长状态较好。本实验课程设计为各小组独立培养Yac-1细胞，然后采用各自小组培养的细胞进行融合实验。实验结束后的调查发现，培养细胞状态不好的小组，其后续的实验很容易失败，在荧光显微镜下无法找到荧光标记的细胞。因此，要求学生在实验中严格规范细胞培养的各项操作，例如PEG溶液滴加时需不断摇晃离心管，以免造成细胞悬液局部PEG浓度过高而损伤细胞。

4 结 语

细胞融合技术广泛应用于生物医药[10]、肿瘤研究[11]、克隆抗体[12]、作物育种[13]、环境微生物学[14]等领域。本次荧光标记细胞融合实验课程的设计，将传统的验证性实验方法转化成综合性实验，并融合多种技术手段，使学生通过清晰、准确的观察对细胞结构有更深一步的了解，有利于激发他们对细胞生物学实验的浓厚兴趣。

随着科学技术发展的日新月异以及细胞生物学在生物研究领域的应用越来越普遍，对本科阶段的《细胞生物学实验》教学进行改革势在必行[15]。今后将进一步通过对教学方法、教学内容、评分标准等进行改革，将经典实验方法与现代实验技术相结合，以期更好地培养学生的创新思维、创新精神和创新能力[16]。