耳叶牛皮消二级浆复合微生物发酵工艺研究

陈 明，方希修，严雅瑶

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

耳叶牛皮消又称滨海白首乌，为萝摩科鹅绒藤属耳叶牛皮消种，是中国历史上较为珍贵的中药保健品，耳叶牛皮消的药理成分主要包括C21甾苷、多糖、多肽、氨基酸、脂类（磷脂、挥发油、不饱和氨基酸、苯乙酮类化合物）等（孙彦敏等，2015），其入口微甜后甘苦、药性微温，可提升机体特异性及非特异性免疫力，还可增强气血、促进开胃消食、解毒化瘀。

本试验选择耳叶牛皮消粉加工过程中的废渣废水（耳叶牛皮消二级浆）为原料，选用各种芽孢杆菌、乳酸菌属细菌菌株的最佳培养基（焉兆萍等，2019；李慧芬，2018；王德培等，2011），菌种经培养扩大后接种到以耳叶牛皮消二级浆为原料的基础发酵培养基中。最终根据发酵液中的粗蛋白质含量分析出耳叶牛皮消二级浆最佳发酵条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料及菌种 新鲜耳叶牛皮消由江苏康诺农业有限公司市场采购；鲜牛奶（脱脂），蔗糖（食品级），泰州某超市购买；微生物菌制剂、芽孢杆菌、链球菌、乳杆菌及乳酸菌由江苏农牧科技职业学院微生物饲料与营养研究所提供。

1.1.2 培养基 枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌（牛肉膏蛋白胨培养基）：胰胨10 g，牛肉膏5.0 g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL。设置pH为（7.2～7.4）。高压蒸汽灭菌锅灭菌，设置温度为121℃，设置时间为20 min，最后灭菌后冷却备用。

保加利亚乳杆菌（牛肉膏蛋白胨培养基）：胰胨10 g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0 g，葡萄糖5.0 g，吐温80 1.0 g，L-半胱氨酸0.1 g，柠檬酸钠1.0 g，硫酸镁0.6 g，硫酸锰 0.3 g，蒸馏水1000 mL（李慧 芬，2018）。设 置pH为（6.8～7.0）。高 压 蒸汽灭菌锅灭菌，设置温度为121℃，设置时间为 15 min，最后灭菌后冷却备用。

嗜酸乳酸菌、嗜热链球菌用培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：胰胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20 g，吐温80 1.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2 g，硫酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.6 g，硫酸锰0.3 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 mL。设置pH为（6.2～6.4）。高压蒸汽灭菌锅灭菌，设置温度为121℃，设置时间为15 min，最后灭菌后冷却备用。

1.2 试验方法

1.2.1 固态复合微生物制剂的制备 制备流程见图1。

图1 固态复合微生物制剂的制备流程

将培养的二代乳酸菌菌株接种到乳酸菌发酵培养基中，接种条件为厌氧。接种量为发酵培养基的5%，随后混匀、静置、密封发酵2.5 d，备用。

将培养的二代芽孢杆菌菌株接种到芽孢杆菌发酵培养基中，提供一定浓度的氧气。接种量为发酵培养基的5%，随后混匀、静置、发酵2.5 d，备用。

1.2.2 耳叶牛皮消二级浆的制备流程

耳叶牛皮消二级浆的制备流程见图2，通常在秋末冬初选购耳叶牛皮消。选择直径大于0.8cm，外观完整、新鲜、无霉变、无病斑的作为原料。耳叶牛皮消清洗之后放入低速滚筒去皮机中，匀速加注耳叶牛皮消原料体积3倍量的清水，翻滚30 min完成去皮。去皮后将新鲜白首乌放入粉碎机中按一定比例进行注水捣碎，过滤。过滤好的浆放入沉淀桶中沉淀1 d左右，待分层后，弃去上层透明清水层，收集中间灰白层，弃去底层乳白淀粉层。重复步骤沉淀、收集2～3次，即得到较为纯粹的耳叶牛皮消二级浆，接着放入烘箱烘干成块并过30目筛，最后灭菌冷却后保存备用。

图2 耳叶牛皮消二级浆的制备流程

1.2.4 活菌数的测定 在超净工作台下进行无菌操作，用滴管吸取一定量的发酵液移入无菌干燥试管内，混合无菌生理盐水或其他灭菌稀释液，充分混匀。复合微生物制剂活菌数用血球计数板计数；发酵后活菌数用平板计数法计数，将细菌培养液用涂布器置于MRS琼脂（3%）平板上，随后覆盖一层薄薄的营养琼脂，静置。待营养琼脂完全凝固，即可将平板倒扣。放入恒温箱中培养，设置温度时间。最终根据固体培养皿上的微生物菌落进行计数。

1.2.5 理化指标

1.2.5.1 蛋白质的测定 量取充分混匀的耳叶牛皮消发酵液至干燥的消化管内，加入硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸等试剂，将消化管放入消化炉中消化，使用全自动凯氏定氮仪，实现加液、蒸馏、滴定和记录等操作。

1.2.5.2 总酸的测定 根据酸碱中和的特性，在无菌干燥的锥形瓶中加入一定量发酵液和酚酞指示剂备用。将碱液置于滴定管中进行滴定，观察溶液颜色变化，试验进行3次，减少误差，最后记录碱液的消耗量，计算出总酸含量。

1.2.5.3 脂肪的测定 通过低沸点有机溶剂萃取的方法测定脂肪，选择石油醚作为萃取剂，量取一定量的发酵液，混合海沙一同置于无菌干燥的蒸发皿中，将蒸发皿置于沸水中加热，使发酵液蒸干。随后将各蒸发皿放入干燥箱中，设置温度与时间，干燥结束后冷却、研细，后移入滤纸包，用石油醚溶液进行抽提，最后蒸干称重，计算可得脂肪含量。

1.2.6 微生物指标 总菌数、大肠杆菌均采用平板计数法，其他致病菌如沙门氏菌的检测需通过平板分离后进行生化鉴定实验和血清检测才能最终鉴定成功（梁智安，2011）。

1.3 数据整理采用L9（34）正交表作正交试验，以粗蛋白质含量（CP%）为指标，采用SPSS19.0分析因变量的影响程度。

2 结果与分析

2.1 固态复合微生物制剂中活细菌数含量通过制作发酵菌株的最佳培养基培养扩增的二代细菌，各菌种主要包括嗜酸乳酸菌（36%）、保加利亚乳杆菌（20%）、枯草芽孢杆菌（18%）、嗜热链球菌（16%）、蜡状芽孢杆菌（10%），每克复合微生物菌剂的有效活菌数为3.09×109，各菌按照比例其数量如下：1.11×109（嗜酸乳酸菌）、0.62×109（保加利亚乳杆菌）、0.56×109（枯草芽孢杆菌）、0.49×109（嗜热链球菌）、0.31×109（蜡状芽孢杆菌）。结果表明，复合微生物菌剂中的活菌可进行正常的新陈代谢，从而在动物机体内发挥促进作用。

2.2 耳叶牛皮消二级浆发酵工艺条件的优化采用L9（34）正交表，以发酵液中粗蛋白质含量（CP%）为指标，优化发酵条件，并通过极差分析评价影响产品质量的因素程度。因素和水平如表1所示，根据CP确定白首乌二级浆发酵的最佳工艺条件，结果见表2、表3。

表2 白首乌二级浆发酵条件的优化结果

表3 白首乌二级浆发酵条件优化的方差分析

由表1、表2可知，发酵温度（A）为30%、发酵时间（B）为24 h、复合微生物制剂添加量为1.5%时，发酵液中蛋白质含量最高为3.89%，可见该组为最佳搭配。根据表格中所计算的极差可知：A＞B＞C，表明发酵效果中的主要影响因素为A，其次为B，C影响效果最小。即发酵温度对液体中蛋白质量影响最大，其次为发酵时间和微生物添加量。对表格整体分析可知，耳叶牛皮消二级浆发酵条件可设定为A2（30℃）、B2（24 h）、C2（1.5%），此发酵条件下发酵液的营养价值最高。

2.3 质量指标

2.3.1 感观指标 样品液呈奶白色，黏稠均匀，浓度适中，风味有浓郁的酸乳香味和白首乌特有的香味，无酸臭异味；口感自然爽滑，细腻温和。表面无乳清、结块析出，无分层浑浊等异常现象。

2.3.2 理化指标 蛋白质2.78 g、酸度56.9° T、脂肪2.35 g。

2.3.3 微生物指标 发酵液中细菌总数≤62 CFU/mL、大肠杆菌＜28 MPN/100mL、致病菌数未检出。

3 讨论

目前国内耳叶牛皮消的市场空前膨胀，但其生产研发程度不高。传统耳叶牛皮消粉的加工材料大部分为淀粉，而活性成分C21甾苷、多糖、挥发油、各种氨基酸等在加工过程中流失于废渣和废水中。现代药理研究表明，甾苷类物质扩散至细胞内可清除自由基，增强免疫细胞活性，从而提升机体非特异性及特异性免疫力，增强机体监测系统对肿瘤细胞的识别，进而抑制肿瘤；脂类等物质大多数为挥发性脂肪酸，分子量较小机体易于吸收，可降低胆固醇。耳叶牛皮消二级浆的排放不但给环境带来了巨大压力，更重要的是浪费了耳叶牛皮消的药用价值。需要开展变“废”为宝的创新性研究，发挥耳叶牛皮消废渣废水中活性物质的药用价值是本试验的关键。

4 结论

试验根据不同菌株的生化特点（好氧菌、厌氧菌）制备不同的培养基进行菌株扩大，又将各二级菌进行配合制成复合微生物制剂。耳叶牛皮消二级浆的最佳发酵条件是发酵温度为30℃、发酵时间为24 h、复合微生物制剂接种量为1.5%时，发酵后二级浆粗蛋白质含量（%）最高为3.89。