小型香猪皮肤放创复合伤动物模型建立及维生素B12软膏促愈作用机制研究

赵悦辰,孔维健,杜昊睿,杨小玉,王铁君*,王嘉鹏,夏雪怡

(1.吉林大学第二医院 放疗科，吉林 长春130022;2.吉林大学第二医院 骨科，吉林 长春130022;3.吉林省一汽总医院 骨科，吉林 长春130011;4.吉林大学第二医院眼科手术室，吉林 长春130022)

放射治疗是目前临床恶性肿瘤的主要治疗方法之一，适用于大多数癌症患者。放射治疗结合外科手术已成为多种实体肿瘤的标准局部治疗方法。在四肢软组织肉瘤的治疗中，采用放疗联合外科手术治疗的方法，尽最大可能保留了功能性组织，避免了根治性切除和近端截肢，同时保持局部肿瘤控制率等于或优于单纯根治性手术[1-3]。此外，这种联合治疗改善了乳腺癌、软组织肉瘤、直肠癌、头颈癌的术后功能和美容效果[4]。然而，术前放射治疗的应用导致了皮肤放射损伤的发生，增加了术后伤口愈合并发症的风险。据报道，在放疗后的皮肤区域进行手术会导致半数以上的软组织肉瘤患者出现并发症，甚至出现迁延不愈的创伤[5-6]。这种合并放射损伤的皮肤创伤称为“放创复合伤”。放射损伤与创伤合并后，常使放射损伤和创伤两方面均有加重，其创面愈合特点更加迁延复杂，可能形成痒痛难忍、溃烂反复的难愈性创伤[7-9]。因此，开发一种能够促进放射合并创伤的特效药物，具有巨大的临床效益与价值。

维生素B12是一种重要的生物活性物质，参与体内多种重要的生化反应。维生素B12可促进肉芽组织增生及上皮细胞再生，对受损皮肤黏膜上皮细胞及血管内皮细胞具有较强的修复再生功能[10-11]。传统上维生素B12用于治疗恶性贫血、神经炎和神经萎缩等疾病。近来研究发现，维生素B12对皮肤创伤、特别是放射损伤也具有一定改善作用。小型香猪是一种常见的实验动物，因其皮肤形态和组织结构与人类皮肤高度相似，被广泛用于构建皮肤模型研究。此外，小型香猪与家兔、豚鼠等动物相比对射线的耐受力更强，死亡率更低。因此，本研究中我们使用小型香猪建立了皮肤放创复合伤动物模型，通过对创面进行形态学和组织学分析，探究维生素B12软膏对皮肤放创复合伤愈合的作用效果及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

小型香猪3只(n=3)，6-7月龄，体重15±2 kg，雌雄不限。饲养在吉林大学基础医学院动物实验中心标准动物室(22℃)。

1.2 皮肤放创复合伤模型构建及形态学观察

照射前对照射区域进行备皮，随后静脉注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，将麻醉后的香猪侧卧位固定于照射台上，使用VARIAN医用直线加速器进行照射。每只香猪三个照射野，照射野大小 6×6 cm，野间距5 cm。照射剂量20Gy，照射剂量率4Gy/min，在受照野上覆盖1 cm等效膜。照射后使用75%乙醇对受试部位皮肤进行消毒，在预先制备的塑料模型基础上制备皮肤创面损伤。用刀片在每个照射野上等距切割3个深达皮下全层的圆形创面，直径25 mm。将创面分为对照组、三乙醇胺组和维生素B12组，维生素B12组涂抹复方维生素B12软膏Ⅱ号(主要成为维生素B12，硫酸庆大霉素)，1次/日；三乙醇胺组涂抹比亚芬烫伤膏(法国Biafine Act)，1次/日；对照组不给予药物处理。

使用直径25 mm圆形塑料片作为参照物，于0、5、9、13、21、25及29天对皮肤放创复合伤的损伤区域进行拍照记录，用图像分析软件(Image-pro plus 6.0)测量创面面积。伤口愈合率根据以下公式确定：愈合率=[(A0-At)/A0]×100%，其中A0是时间为0时伤口的初始面积(t=0)，At是测量时的伤口面积。

1.3 组织学分析

模型构建后第29天对香猪进行安乐死，对各个皮肤放创伤损伤区域的组织进行取材。4%多聚甲醛固定24 h后进行包埋切片，厚度4 μm。使用相应的试剂盒对切片进行HE染色、Masson染色及天狼猩红染色，倒置光学显微镜观察组织变化。应用Image-Pro Plus6.0软件对天狼猩红染色切片分析，得出每张照片Ⅰ型和Ⅲ型胶原面积比。

1.4 统计学分析

所有定量数据均采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和t检验对两个以上变量进行比较,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 放创复合伤创口愈合情况

利用Image-pro plus 6.0软件，我们对模型构建后不同时间节点皮肤创面的愈合情况进行了分析。在术后第一天时，各组均表现为明显的皮肤放创损伤缺损，随着时间的延长，各组的创面均开始不同程度的愈合。如图1、2所示，在术后第9天前，三组创面之间的愈合情况并无显著差异，从第13天开始，维生素B12组的放创伤创面开始明显缩小，愈合率与对照组和三乙醇胺组相比显著提升。三乙醇胺组与对照组相比较，在术后第21天前愈合速率和放创伤创面情况均无明显差异，第25天时开始出现明显区别，愈合速率较对照组相比出现明显提升。至术后第29天时，维生素B12组愈合率为85.2%，三乙醇胺组愈合率为47.9%，对照组愈合很差，仅34.5%。与对照相比，维生素B12组、三乙醇胺组愈合率有统计学意义(P<0.05)。通过愈合率曲线发现，对照组一段时间内创面面积停留在相对恒定水平，即创伤愈合停滞期，成为经久不愈的“难愈性创伤”。维生素B12组与三乙醇胺组相比，愈合率较高(P<0.05)，证明维生素B12软膏对放创复合伤的促愈作用优于对照药物三乙醇胺。

图1 不同时间点各组实验动物皮肤放创复合伤外相

2.2 放创复合伤模型中各组的组织学的改变

皮肤的愈合过程中涉及多种细胞、组织和生长因子的相互作用，其中损伤后肉芽组织的形成、上皮化及皮肤附属器官的再生是主要组成部分。利用HE染色我们对上述组织学变化进行了观察，结果如图3所示，可以看到对照组和三乙醇胺组创面区域可见大量结痂，新生组织结构较为疏松，而在维生素B12组中观察到损伤中心区域无明显结痂，组织结构更加致密，同时损伤区域再生组织与损伤两侧相比较并无明显的分界线，这说明维生素B12组中形成的新生组织具有更高的融合度，能够显著促进皮肤放创复合伤后损伤区域的皮肤再生。此外我们还应用Image-pro plus 6.0软件测量了各组相对表皮厚度、相对创口宽度。结果发现，与对照组相比，维生素B12组、三乙醇胺组相对表皮厚度显著减小(P<0.01)；同时维生素B12组与对照组和三乙醇胺组相比，相对创口宽度显著减小(P<0.01)。这些结果进一步证实了维生素B12软膏对促进放创复合伤的愈合具有积极的促进作用。

图2 各实验组皮肤愈合曲线

图3 皮肤放创伤损伤区域HE染色

放射损伤可造成皮肤大量胶原沉积形成，胶原和其他细胞外基质成分的过度堆积是导致放射性纤维化的重要原因。利用Masson染色，我们对损伤区域组织胶原纤维的含量进行了检测。结果发现在放创复合伤模型中，Masson染色可见各组胶原沉积均增多(图4)，维生素B12组胶原沉积量略少。因此，我们推测维生素B12对抑制放创复合伤中胶原瘢痕及纤维化形成有一定作用。

图4 皮肤放创伤损伤区域Masson染色

2.3 放创复合伤模型中各组胶原表达量的改变

正常皮肤组织中，皮肤胶原成分主要以Ⅰ型胶原为主。皮肤创伤形成后，由于成纤维细胞大量增殖及分化延迟，导致胶原纤维大量沉积，此时主要以分泌Ⅲ型胶原为主。随着组织修复程度提高，Ⅲ型胶原逐渐被Ⅰ型胶原所替代。因此，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例可在一定程度上评价皮肤损伤的修复程度。利用天狼猩红染色，我们观察了各组不同处理后皮肤胶原含量的改变。在偏振光下，Ⅰ型胶原呈红色或黄色，强双折光性。Ⅲ型胶原呈绿色，弱双折光性。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析，得出Ⅰ型和Ⅲ型胶原面积比。结果显示，在放创复合伤模型中，各组中胶原总量相差不大。但在Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的比较中，发现维生素B12组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例显著升高(P<0.01)，证明维生素B12组中成熟胶原较多，愈合效果良好。

图5 各实验组相对表皮厚度和创口相对宽度

图6 皮肤放创复合伤损伤区域天狼星红染色

图7 各实验组总胶原相对表达量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比例

3 讨论

放射治疗联合手术在多种肿瘤治疗过程中显示出巨大的优越性。首先，术前对肿瘤照射可以减少放射治疗的总照射剂量[12]。其次，在手术切除肿瘤前进行放射治疗，所受照射的正常组织体积要小得多[13]。以上因素均有助于减轻射线对肿瘤周围正常组织造成的损伤，有助于改善患者的生存质量[14-15]。然而，术前实施的新辅助放疗已被证实会引起手术伤口愈合的强度降低，造成伤口愈合缓慢甚至迁延不愈。皮肤组织受照射后会引起微血管损伤，导致血流量减少、缺血性损伤、纤维化、坏死、萎缩等。此外，胶原沉积缺陷、成纤维细胞辐射后发生功能异常，也是辐射后伤口愈合较差的重要原因[16]。

维生素B12是一种水溶性维生素。作为体内重要的生物活性物质，维生素B12以多种形式存在于体内，是同型半胱氨酸甲基转移酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅酶，也是细胞合成核酸过程中的重要辅酶。维生素B12对于人体至关重要，尤其是血液和神经系统。外用维生素B12具有止痒、止痛及修复血管内皮细胞损伤的作用[17-18]。近来研究发现，维生素B12可改善放射线引起的皮肤、黏膜损伤，减轻放创反应，并显示出了良好的效果[19-20]。

小型香猪是一种常见的实验动物，因其皮肤形态和组织结构与人类皮肤高度相似，被广泛用于构建皮肤模型研究。本研究中，我们使用小型香猪建立皮肤放创复合伤模型，设置对照组，三乙醇胺组，维生素B12组，随后各自用药处理。研究结果发现，维生素B12软膏对放创复合伤的愈合和恢复具有明显的促进效果。与对照组、三乙醇胺组相比，维生素B12组创口愈合率显著升高，具有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果表明，维生素B12组药后减轻了放创复合伤的皮肤破坏程度。软件测量显示，与对照组相比，维生素B12组相对表皮厚度、相对创口宽度显著减小(P<0.01)，与形态学结果一致，证实了维生素B12软膏对放创复合伤愈合的积极作用。Masson染色表明，与对照组、三乙醇胺组相比，维生素B12组减少了皮肤胶原沉积量，可推测维生素B12对抑制放创复合伤中胶原瘢痕及纤维化形成有一定作用。天狼星红染色结果表明，与Control组、三乙醇胺组相比，维生素B12组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例显著升高(P<0.01)，证明维生素B12组中成熟胶原较多，愈合效果良好。