多梳基因家族成员的Bmi-1与Ki67蛋白表在大肠肿瘤组织的表达情况及预后相关性

郭俊龙，梁 滨，田伟军

(1.天津市宁河区医院，天津301500；2.天津医科大学总医院，天津300052)

大肠肿瘤属于临床上常见的一种消化道肿瘤，随着人们生活水平的提高和环境污染加剧，发病率逐年上升。在一些发达国家，大肠癌的发病率居第二位，而在我国，其发病率和死亡率分别为第三位和第四位，1991年首次从转基因小鼠传代淋巴瘤细胞中鉴定出Bmi-1基因是多梳基因家族成员(PcG)的一员[1-2]。Bmi-1属于一种愿癌基因，在c-myc辅助下形成肿瘤。因此越来越多研究者开始关注Bmi-1和恶性肿瘤的发生与预后关系。但是关于Bmi-1基因和大肠肿瘤发生与发展的关系研究比较少见[3]。Ki67属于细胞核上的一种非组蛋白，半衰期短，与细胞增殖有关。许多研究表明[4-5]，Ki67蛋白表达水平和细胞的增殖息息相关，并能够反映出细胞的增殖程度。本文以Bmi-1和Ki67两种蛋白的表达水平为例，应用免疫组化方式进行检测，并探讨两者与大肠肿瘤和大肠癌中的表达意义，因此本文选取天津市宁河区医院2017年2月到2019年2月共收治的100例大肠肿瘤患者作为研究对象进行研究，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取天津市宁河区医院2017年2月到2019年2月共收治的100例大肠肿瘤患者作为研究对象，所有患者通过病理检查发现，100例大肠肿瘤患者中有60例为大肠癌，分，40例为大肠腺瘤患者，另取同期20例健康体检患者的正常大肠黏膜组织，分为对照组。其中60例大肠癌患者的临床资料完整，手术之前没有进行过放疗和化疗，且随访3年以上。其中100例大肠肿瘤患者中男性55例，女性45例，年龄为18到85岁，平均年龄(63.41±1.64)岁；所有患者均符合大肠肿瘤诊断标准。20例健康体检者之中，男性13例，女性7例；年龄为23-80岁，平均年龄(63.67±1.46)岁。两组患者一般资料对比无明显差异，可以进行对比。

1.2 方法

取标本进行连续切片，厚度为4 μm，并应用二甲苯进行脱蜡脱水处理之后，应用3%的过氧化氢溶液梯度乙醇进行处理，从而阻断内源性过氧化物酶，并应用PBS缓冲液洗涤，然后用小鼠抗人Bmi-1单克隆抗体(1∶150稀释，美国北部)冷却组织加入和小鼠抗人Ki67单克隆抗体工作液(上海长岛公司)分别加入，然后在孵育37℃水浴1小时，用PBS缓冲液冲洗，EnVisionTM添加二级抗体，然后在37℃水浴中孵育30分钟，再次用PBS缓冲液洗涤，并用新制的DAB溶液显影。用Mayer染料对细胞核稍作双重染色，然后用梯度乙醇脱水，用中性香脂封闭，显微镜下观察。并以实际染色切片作阳性对照，阴性对照应用PBS的条带次级抗体阻断切片。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Bmi-1和Ki67蛋白在大肠肿瘤中的表达

Bmi-1阳性蛋白表现为细胞核内呈棕褐色或褐色颗粒，胞浆内少量呈褐色染色(见图1)。大肠癌Bmi-1阳性表达数量为31例，表达率为51.7%，高表达15例，占比25.00%。40例大肠肿瘤患者中， 5.00%(2/40)高表达，20例正常对照组中0%的大肠黏膜有高表达。因此，大肠癌组织之中的Bmi-1蛋白高于大肠瘤组织(P<0.05)，而腺瘤组与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。Ki67在细胞核中的表达及其阳性表达以细胞核内存在褐色或棕色颗粒为标志,见图1。Ki67高表达人数11例，占比18.30%； 40例大肠腺瘤中有1例高表达(严重不典型增生)，高表达率为2.50%(1/40)；20例对照组患者Ki67表达低于大肠瘤组和大肠癌组(P<0.05)，而腺瘤组与正常对照组之间的表达无显著性差异(P>0.05)。

图1 Bmi-l和Ki67蛋白在大肠肿瘤组织中的表达(SPX400)。(A) 正常大肠组织中Bmi-l的阴性表达；(B) Bmi-l在大肠腺瘤细胞核中弱表达(黄色)；(C)Bmi-l在结直肠肿瘤细胞核中的强表达(棕色)；(D)正常结直肠组织中Ki67的核染色阳性(棕黄色)；(E)结直肠癌中Ki67的核染色阳性(棕黄色)；(F) 大肠癌中Ki67的强核染色(棕色)。

2.2 60例大肠癌的临床病理特点分析

Bmi-1蛋白表达与大肠癌转移及TNM分期相关，即有远处转移者Bmi-1蛋白表达明显高于无转移者(P<0.01)。在TNM分期下，Ⅲ/Ⅳ期患者Bmi-1蛋白表达比Ⅰ/Ⅱ期患者高(P<0.05)，和患者的分化程度、肿瘤部位、大小、患者的年龄和性别无明显关系，淋巴结转移的组织学分类或发生率(P>0.05)，见表1。Ki67蛋白高表达与患者年龄、远处转移和TNM分期相关(P<0.05)。

表1 60例大肠癌的临床病理特点分析(n)

2.3 Bmi-1表达影响因素的Logistic回归分析

logistic回归分析显示只有远处转移与Bmi-1蛋白表达相关，也就说说远处转移属于Bmi-1蛋白的高风险因素(P<0.05)，见表2。

表2 Bmi-1表达影响因素的Logistic回归分析

2.4 Ki67表达影响因素的Logistic回归分析

进一步的logistic回归分析显示，只有年龄与Ki67蛋白高表达相关，即年龄越小，Ki67表达越高(P<0.05，B=-1.921，OR=0.146)，见表3。

表3 Ki67表达影响因素的Logistic回归分析

2.5 Bmi-1、Ki67蛋白表达与大肠癌预后相关性

Bmi-1蛋白高表达患者的生存率显著低于低表达患者(P=0.015)，而Ki67蛋白高表达患者的生存率显著低于低表达患者(P=0.000)，见图2。

图2 低或高表达Bmi-1或Ki67的结直肠癌患者的生存曲线

2.6 大肠癌组织中Bmi-1和Ki67蛋白表达的预测价值

Spearman相关分析显示Bmi-1与Ki67蛋白表达有一定程度的正相关，但相关性较弱，无统计学意义(r=0.224，P=0.086)，见表4。

表4 大肠癌组织中Bmi-1和Ki67蛋白表达的预测价值

3 讨论

肿瘤发生的多基因突变机制尚不清楚，人类Bmi-1基因在10号染色体断臂13区，其中有10个内含子与10个外显子。Bmi-1的基因编码中有326个氨基酸核蛋白。Bmi-1蛋白的结构和果蝇蛋白结构类似，属于中部DNA结构，N端环指结构，因为这两个DNA区域和肿瘤形成具有相关性[6-7]。

当前已经有许多研究之中表明Bmi-1与肿瘤表达明显相关。相关研究显示[8]，51例大肠癌组织和癌旁正常黏膜组织中Bmi-1基因的表达，发现Bmi-1mrna在大肠癌组织中的表达高于正常大肠主治的2到3倍。并且65%的患者Bmi-1蛋白呈中到强染色，其中p16INK4a和p14ARF的表达水平明显下降，与大肠癌的发生发展有关。然而，我们的资料并未显示与预后的关系。这一发现与最近其他研究所获得的相似数据相一致，这些研究证实Bmi-1在人体内部会直接参与肿瘤发生、侵袭与转移。相关研究显示[9]，Bmi-1白丹水平与乳腺癌临床分期呈正相关，也预测了Bmi-1可能属于乳腺癌的一种新标志物。还有研究中显示[10-11]，Bmi-1为阳性的大肠癌患者5年的生存率低于Bmi-1阴性患者。另外，Bmi-1mRNA阳性表达患者的生存率远低于Bmi-1mRNA表达阴性患者，因此检测Bmi-1mRNA有助于判断肿瘤的发展和预后。本研究结果表明，Bmi-1在大肠癌组织中的阳性表达率为51.7%。在本研究中，Bmi-1在癌组织中的高表达率为25.0%，但是在常常组织与大肠腺瘤组织之中Bmi-1蛋白表达降低， 其中有2例大肠腺瘤患者Bmi-1蛋白高表达，1例健康者有严重的非典型增生，另1例有癌变。经统计学分析，Bmi-1蛋白在大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠组织中的高表达有显著性差异(P<0.05)。本研究还显示，Bmi-1蛋白高表只与患者肿瘤TNM分期和远处转移有关。其中，有远处转移的结直肠癌患者Bmi-1蛋白表达明显高于无远处转移的患者(P<0.01)，TNM分期III-IV患者Bmi-1蛋白表达明显高于I-II期患者(P<0.05)。logistic回归分析显示只有远处转移与Bmi-1蛋白表达相关，也就说说远处转移属于Bmi-1蛋白的高风险因素(P<0.05)，由此证明，Bmi-1在大肠癌组织中表达比较高也是判断大肠癌转移与侵袭的重要因素。而且本研究的生存区县中也发现，Bmi-1蛋白高表达患者5年生存率低于低表达患者，因此可以应用Bmi-1蛋白作为大肠癌患者的预后判断指标。

相关研究表明[13]，Ki67会参与细胞的增殖，也是对肿瘤恶性程度与侵袭能力判断的重要指标。还有研究表明[14]，表明Ki67的表达与肿瘤部位、淋巴结转移、Dukes分期和生存期有关。具体而言，Ki67在淋巴结转移组中的表达比无淋巴结转移组增加，并且随着Dukes分期的推进而显著增加。Ki67阳性表达高患者的生存率比阴性表达患者低，这也证明了Ki67阳性表达患者的预后较Ki67阴性患者差。因此，Ki67对预测结直肠癌预后有重要参考价值，属于独立预后指标的一种。本研究结果之中，Ki67在细胞核中的表达及其阳性表达以细胞核内存在褐色或棕色颗粒为标志。Ki67高表达人数11例，占比18.30%； 40例大肠腺瘤中有1例高表达(严重不典型增生)，高表达率为2.50%(1/40)；20例对照组患者Ki67表达低于大肠瘤组和大肠癌组(P<0.05)，而腺瘤组与正常对照组之间的表达无显著性差异(P>0.05)，这说明，Ki67蛋白在大肠癌患者的表达之中增强，因此可以证明Ki67与大肠癌的发生与发展具有相关性。在进一步研究中发现，年轻患者的Ki67蛋白高于老年患者，并且其水平会随着TNM的分期而逐渐增加。进一步回归性分析显示，年龄越小的患者，Ki67蛋白表达水平也就越高(P<0.05)，由此证明，大肠癌患者的年龄越小，肿瘤细胞的增殖越旺盛，而且恶性程度越高，预后越差。在生存分析中也显示，Ki67蛋白高表达患者的生存率低于低表达患者，由此可以证明Ki67的高表达能够判断大肠癌的预后情况。

Spearman相关分析表明，大肠癌中Bmi-1蛋白表达与Ki67蛋白表达有一定的正相关，但无统计学意义(r=0.224，P=0.086)。其原因可能是本研究样本数较少或Bmi-1蛋白参与调节Ki67蛋白表达，或Bmi-1蛋白对Ki67蛋白的间接调控。要解决这些问题还需要进一步的研究。

综上所述，Bmi-1和Ki67蛋白的高表达与大肠癌的发生、转移及预后密切相关。Bmi-1和Ki67可用于预测大肠癌的预后。Bmi-1可能间接调节CRC患者Ki67的表达。