let-7i对卵巢癌细胞生物学行为的调控作用机制分析

张伟娜

(佳木斯市中心医院 妇产科,黑龙江 佳木斯154000)

卵巢癌是妇科较为常见的一种恶性肿瘤，且该病死亡率很高。据不完全统计：我国每年约有50000例卵巢癌新发病例[1]。卵巢癌早期无任何临床症状，且该病早期诊断指标特异性不强，使得该病的早期筛查难度加大，从而导致绝大部分患者发现卵巢癌时病情已进入晚期[2-3]，虽然经过一段的治疗，患者病情有所好转，然而患者后期生存率仍然较低，且极易复发[4]。所以，应探寻特异性较高的指标，从而及早发现并未临床治疗提供一定的依据。近些年来，let-7i在肿瘤进展中的重要作用备受关注。现有研究发现：let-7i在淋巴癌、头颈部鳞状细胞癌组织中表达水平较高[5-6]，但是在消化系肿瘤中的表达水平较低[7-8]。国外有研究结果显示[9]：与良性卵巢肿瘤比较，卵巢癌患者let-7i miRNA表达水平明显下降。本研究主要采用临床基础实验的方法，着重探讨了let-7i对卵巢癌细胞生物学行为的调控作用机制，现报道如下。

1 材料及方法

1.1 实验材料人卵巢癌SKOV3细胞以及人永生化卵巢上皮细胞IOSE均由本院实验室提供；人卵巢癌A2780细胞：均购自于武汉普诺赛生命科技有限公司。上述细胞均保存于温度37℃、二氧化碳(V%)为5%以及饱和湿度的培养箱中进行培养。

1.2 研究方法

1.2.1细胞转染 主要步骤包括：①首先消化处于对数期的细胞，并对这些细胞进行计数，使用培养基(不含抗生素)于培养板中进行接种；次日，细胞汇合度可达50%；②使用培养基(不含血清及抗生素)以一定的比例将细胞转染试剂Lipofectamine TM2000与let-7i mimics、let-7i inhibitor及其相应的阴性对照进行混合，静置时间均为5 min；③将上述按照一定比例混合的转染试剂与miRNA寡聚物充分混匀，静置时间为5 min；④将上述混合液加入至培养基之中，继续进行培养。

1.2.2CCK-8实验 主要步骤包括：①首先消化对数生长阶段的细胞，并对这部分细胞进行计数，以每孔规格为2000个计数将其接种于96孔板之中，100 μL/个，重复实验数为6个；②次日，将let-7i mimics等转染至细胞；③转染12-72 h之后，向每孔加入20 μL的CCK-8试剂，培养时间为2 h；④于波长为450 nm下使用酶标仪测定吸光度值，然后据此绘制一套吸光度值与浓度之间的生长曲线。

1.2.3Transwell迁移实验 主要步骤包括：①消化、计数处于对数生长期的细胞，使用不含有血清培养基配制成细胞悬浮液(细胞比例为2.0×105个/mL)，向每个Transwell小室孔中加入100 μl的上述细胞配制液；②将上述小室放于24板孔之中，使用震荡法将小孔中的气泡排尽，继续培养16 h；③使用棉签将上述小室中的细胞缓缓擦去，然后将其置于浓度为4%、体积为600 μl的多聚甲醛之中固定0.5 h；④将细胞固定液丢弃，使用浓度为0.1%的结晶紫溶液进行染色半小时，然后将上述染液丢弃，并使用PBS清洗液进行清洗数次；⑤于倒置的显微镜下对上述染色情况进行观察，对细胞进行计数，并取均值。

2 结果

2.1 不同卵巢细胞中的let-7i表达水平对比经检测，A2780细胞与SKOV3细胞中的let-7i表达水平均分别显著低于IOSE细胞(P均<0.05)，但A2780细胞与SKOV3细胞中的let-7i表达水平差异无显著的统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同卵巢细胞中的let-7i表达水平比较

2.2 let-7i mimics转染细胞后的let-7i表达水平分析对于SKOV3细胞及A2780细胞而言，let-7i mimics转染细胞后的let-7i表达水平均分别显著高于阴性对照组(P均<0.01)，见表2。

表2 let-7i mimics转染细胞后的let-7i表达水平

2.3 let-7i对细胞迁移以及侵袭的影响分析(1)let-7i对细胞迁移的影响：首先将let-7i mimics转染为卵巢癌SKOV3细胞，将let-7i 阴性对照转染为卵巢癌A2780细胞，并开展Transwell实验，并于100倍倒置显微镜下对细胞数量进行观察、计数。结果显示：let-7i转染后SKOV3细胞以及A2780细胞数量均显著小于let-7i阴性对照组(P均<0.05)，见表3。(2)let-7i对细胞侵袭的影响：首先将let-7i以及let-7i阴性对照组分别转染卵巢癌SKOV3细胞，于200倍倒置显微镜下对细胞数量进行观察、计数，结果显示：let-7i转染组SKOV3细胞数量为(58.28±4.59)个，显著小于let-7i阴性对照组(96.37±10.21)个(P<0.05)。

表3 let-7i转染组SKOV3及A2780细胞与let-7i阴性对照组细胞数量比较个)

3 讨论

在2015年国外有专家学者应用基因芯片技术从卵巢癌与卵巢良性肿瘤细胞中鉴定出来的4种miRNA中，其中就有let-7i，并发现：该因子在卵巢癌细胞中的表达水平较低。此结果表明：卵巢肿瘤恶性程度越大，let-7i表达水平越低[10-12]。目前，临床上尚未对let-7i在卵巢癌发病中的具体作用机制予以明晰。本研究开展的目的旨在进一步弄清该因子在卵巢癌发病中的作用机制及其对细胞生物学行为的影响。

本研究主要采用CCK-8实验以及Transwell迁移实验等方法探讨let-7i对卵巢癌细胞生物学行为的调控作用机制。最初由国外Mosmann[13]所创立的MTT细胞增殖方法，由于其具有价格低廉、放射性低等方面的优势之处，因此在细胞生长增殖过程中得到了十分广泛地应用。但是在实际操作过程中，MTT还原成地蓝紫色甲瓉具有不溶于水的特点，在换液时常常会出现一定的损失，且在这个过程中，需要使用对人体有损伤的有机溶剂来对甲瓒加以溶解。那么，这种方法逐渐被CCK-8实验所代替，由于CCK-8试剂可以被琥珀酸脱氢酶还原成为的物质水溶性较高，无需细胞裂解环节，那么就可以直接对let-7i含量加以测定。本研究中使用的CCK-8实验方法检测let-7i对卵巢癌细胞增殖产生的影响，结果显示：对于SKOV3细胞及A2780细胞而言，let-7i mimics转染细胞后的let-7i表达水平均分别显著高于阴性对照组(P均<0.01)。

机体的正常细胞向肿瘤细胞进展之中牵涉到细胞对凋亡信号地逃避，能够很好地维持增殖能力与肿瘤转移地获取等，癌细胞经体腔、血管以及淋巴等路径转移播散至人体其他部位继续生长，肿瘤直接长成肉眼可见大小。癌症患者死亡的最为重要的原因就是癌细胞转移[14]。卵巢癌发病隐匿性较强，目前尚无一种有效的疾病早期检测方法，大多数患者在确诊时，已处于癌细胞转移扩散的晚期[15]。所以，应该探寻影响卵巢癌细胞浸润转移的具体因素，从而对卵巢癌迁移、侵袭具有较好的控制效果，有效改善患者预后状况。本研究中所使用的Transwell实验对卵巢癌细胞迁移、侵袭水平进行检测分析，Transwell小室是一种底部带有8μm微小孔径的聚碳酸酯膜的装置，共分2个小室，即：上室(不含有血清培养基将癌细胞接种的位置)、下室(加入完全培养基)。卵巢癌细胞迁移能力代表的是细胞自上室穿至下室的数量大小。本研究中所开展的Transwell细胞侵袭实验中，将基质胶铺在上室，于室温条件下基质胶聚合形成具有生物学活性的三维基质。癌细胞能够分泌于肿瘤转移过程中扮演重要角色的酶类，可以对细胞外基质的蛋白成分加以降解，对组织学屏障产生损伤作用[16]。从而将细胞基质胶加以降解，并穿过小室微孔。该方法已在临床基础实验中得到了非常广泛地应用，如Yang等[17]、Li等[18]、Zheng等[19]均应用此方法研究肿瘤细胞的增殖以及侵袭能力。本研究基于Transwell法研究let-7i对卵巢癌细胞的侵袭能力的影响，结果显示：let-7i转染组SKOV3细胞数量为(58.28±4.59)个，显著小于let-7i阴性对照组(96.37±10.21)个(P<0.05)。此结果表明：let-7i在卵巢癌细胞转移过程中具有较强的研究意义。

综上所述，let-7i在卵巢癌发病过程中表达水平下降，且能够有效抑制卵巢癌细胞增殖以及迁移等过程。