中山地区淋球菌头孢菌素敏感性及NG-MAST研究

陆善词 梁 栋 梁连辉 高文军 蔡常辉

中山市第二人民医院,中山,528447

目前，注射用头孢曲松和口服头孢克肟是全球大多数国家和地区用于治疗淋病的一线药物。因抗生素的滥用和市场监管不足，以及淋球菌易获取外源性耐药基因的特性，近年来，多个国家出现对头孢曲松高度耐药的淋球菌株，甚至出现口服头孢菌素类药物治疗淋病失败的病例[1,2]。NG-MAST基因分型技术是一种可监测特殊菌株的暴发流行、耐药性及菌株进化等情况的有效方法[3,4]。本研究目的是探讨中山市辖区淋球菌对头孢曲松、头孢克肟的耐药性及分子流行病学特征，为临床治疗及预防提供依据。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株收集及药敏试验 淋球菌收集于2017年5月至2018年10月中山市12个淋球菌耐药监测点共193株，菌株经过分离培养、鉴定和纯化后用10%小牛血清保存管冻存于-70℃低温冰箱中。淋球菌基础培养基成分包括英国Oxoid公司GC琼脂粉(批号：2202790)与无菌脱纤维羊血(购自广州迪景公司)。头孢曲松与头孢克肟2种抗生素，以及世界卫生组织(WHO)标准菌株 (WHO G、WHO J、WHO K、WHO L、WHO P)均由中国疾病预防控制中心性病控制中心提供。采用WHO推荐的琼脂稀释法检测菌株对头孢曲松与头孢克肟的药敏值(MIC值)。结果判定标准为头孢曲松MIC<0.125 mg/L为敏感，MIC≥0.125 mg/L为低敏；头孢克肟为MIC<0.25 mg/L为敏感，MIC≥0.25 mg/L为低敏。临床菌株与标准菌株复苏后，经2次传代，用18～20 h新鲜培养物配成0.5麦氏浓度菌悬液，菌悬液再经10倍稀释后接种于含抗生素的琼脂平板上，将平板置于35℃二氧化碳箱培养24～48 h观察结果。每批试验均加入已知MIC值的标准菌株进行全程质量控制。

1.2 DNA提取 淋球菌株复苏经2 次传代后，刮取平板上菌落于无菌生理盐水中制成均匀的混悬液，并调整菌悬液浓度至0.5麦氏单位。Expure-20r全自动核酸提取仪及配套试剂(批号：20180603)由深圳汇研科创生物科技有限公司生产。实验方法如下：向试剂盒六联管第一孔加入180 μL菌悬液和20 μL核酸吸附剂，混匀后上机，仪器即可全自动完成核酸的纯化和提取。

1.3 NG-MAST分型 用Martin等文献报道方法[4]。实验步骤如下：用PCR法扩增porB基因和tbpB基因，产物经凝胶电泳后，将正确位置条带产物进行纯化后测序(由南京勒伯生物技术有限公司完成)。porB基因测序结果与基因库中已知序列(Gen Bank号:M21289)进行比对，选取por B基因扩增序列上一段490 bp大小片段进入NG-MAST网站比对以获取其等位基因型别；tbpB基因测序结果与基因库中已知序列(U65222)进行比对，选取tbpB基因扩增序列上一段390 bp大小片段进入NG-MAST网站比对以获取tbpB基因等位基因型别；最后综合porB和tbpB基因的等位基因型别从NG-MAST网站获取该淋球菌株的基因型别。

2 结果

2.1 药敏试验结果及MIC值分布 共检测193株临床分离淋球菌，头孢曲松的低敏率为5.2%，头孢克肟的低敏率为13.5%。淋球菌株对2种抗生素的MIC值分布见表1。

表1 淋球菌株对2种抗生素的MIC值分布 株

2.2 NG-MAST型别分布 193株淋球菌共检出125个型别，其中已知型别65(52%)种，新型别60(48%)种。菌株型别中以ST5308(n=7)、ST2268(n=7)、ST5061(n=7)、ST10091(n=4)、NEW1(n=6)、NEW2(n=4)和NEW3(n=4)为优势型别，其中两株菌同型别有21种，3株菌同型别有7种，其余为90种单一型别。

表3 优势型别菌株对头孢克肟的MIC值分布 株

2.3 NG-MAST优势型别菌株对头孢菌素的MIC值分布及耐药情况 从表2、3中可见相同NG-MAST型别菌株对同一药物敏感性具有相同或相近的MIC值，滴度相差不超过3个浓度级。7株ST5308型别菌株中有6株对头孢克肟显示低度敏感。另检出成簇的ST 9659(n=3)型别菌株对头孢曲松显示低度敏感(MIC值均0.125 mg/L)。

表2 优势型别菌株对头孢曲松的MIC值分布 株

3 讨论

本研究发现,中山地区淋球菌株对头孢曲松与头孢克肟的低敏率较高(5.2%和13.5%)，其中头孢曲松的低敏率明显高于近年国内山东(1.6%)、浙江(0.0%)的报道[5，6]，亦高于Chen等监测2012-2013年全国淋球菌株的报告水平(平均4.4%)[7]，但略低于2017年广州地区的耐药监测报道(6.9%)[8]；头孢克肟的低敏率高于近年广西壮族自治区的耐药监测报道(11.3%)[9]，但与近年广州地区的耐药监测报道接近(15.8%)[8]。研究表明，中山地区淋球菌对第三代头孢菌素有较高的低敏率，应重视淋球菌的耐药性监测工作，以及加强临床用药的合理性和规范性使用管理。

Martin等[4]创建的NG-MAST基因分型法，是对两个编码淋球菌外膜蛋白基因(porB和tbpB)进行多态性测序分析，并与数据库比对后获得菌株的基因型别。该法具有操作简便、结果客观、实验室间的可比性高等。有研究表明，ST型别相同菌株对同一抗生素的敏感性存在较稳定的一致性(MIC值集中于特定范围)，由此可通过ST型别预测菌株对药物的敏感性，并适合特定区域追踪特殊菌株(如耐药菌株)的传播特征[9，10]。本研究发现:所检菌株型别多达125种，其中已知型别与新型别种数分别为65(52%)和60(48%)种；印证同型别菌株对同一抗生素敏感性(MIC值)具相同或相近性的报道[10]；发现多个特殊菌株型别，即优势型别ST5308(n=7)菌株对头孢克肟呈低度敏感，与Yan等报道一致[11]；成簇的ST 9659(n=3)型别菌株对头孢曲松低度敏感； ST 10091(n=4)优势型别菌株恰为作者对本批菌株进行阿奇霉素耐药性另一研究中的对阿奇霉素呈高度耐药性的淋球菌(MIC值≥256 mg/L)[12]，对该型别的耐药性于邻近的深圳市曾有报道，但不属于当地的优势菌株型别[13]。上述情况表明，本地区淋球菌株NG-MAST 基因分型呈遗传背景的多样性，可通过检测发现的特殊菌株型别，预测感染菌的耐药性并指导临床选用合理的治疗方案，以及对提前干预特殊菌株的暴发流行有重要意义。

本市主要流行的ST5308、ST5061曾被Qin等报道为珠海市和广州市流行的主要菌型，ST5061还是长沙市流行的主要菌型[14，15]。由于NG-MAST 基因分型法具较高分辨率，检测技术标准化和结果具稳定性[16]，推测广州、珠海、中山三市作为经济发达地区，湖南则毗邻广东，是重要劳工输出地，四地区间人员的流动性强，导致上述淋球菌型别的流行，ST5308、ST5061是上述四地共同流行的主要基因型别，提示可能存在一定的性传播网络关系。此外，近年本市与广州地区的淋球菌对头孢克肟的低敏率接近，可能与两地共同出现对头孢克肟低敏的优势菌型ST5308有较大关系(占中山低敏菌率25%)。本地主要流行菌型ST10091在周边或外省未见报道，提示该淋球菌型存在地域局限性流行情况，可能与该型别菌流入本市较早、传播较广并形成当地主要流行菌型有关。目前，为延缓淋球菌对头孢菌素耐药性进展，世界卫生组织推荐头孢曲松联合阿奇霉素作为治疗淋病的策略，但本市淋球菌对阿奇霉素的耐药性高[12]，并且出现对阿奇霉素呈高度耐药性的ST10091优势菌型，因此在中山地区不宜或慎用该策略。研究未发现在世界范围内传播较广对头孢菌素高度耐药的ST1407淋球菌菌型，但其在国内的上海、广西及我省广州均有零星报道[7，14]，因此要高度关注该耐药菌型和做好耐药监测工作，以防流入本市。此外，本地区流行的主要菌型与Chen等报道我国最主要流行基因型不同，其报道为:所有地区流行ST2318；ST1866流行于南方(包括广东，广西和海南)和华东地区(包括浙江，江苏和上海)；ST5062流行西南部；北部流行ST10290；而西北部流行ST4846[7]。说明不同地域所流行主要菌型可不相同。因此，为掌握中山地区淋球菌的分子流行病学状况和落实淋病防控工作，运用NG-MAST基因分型技术进行监测并建立区域菌株型别数据库十分必要。