反常性痤疮一家系NCSTN基因新致病突变报道

缪梦宇 王真真 孙乐乐 刘 红 张福仁

1滨州医学院，山东烟台，264003；2山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院,山东省皮肤病性病防治研究所)，山东济南，250022

反常性痤疮(acne inversa, AI)，又名毛囊闭锁三联征，是一种慢性、复发性、炎症性、消耗性的皮肤毛囊疾病，1839年Velpeau等首次报道并描述，1975年Plewig等[1]提出反常性痤疮的命名。国外报道，AI发病率从1/103～40/103不等[2]，女性多于男性，临床表现为复发性的排出性窦道和脓肿后疤痕形成，主要好发于大汗腺区，常累及腋窝、腹股沟、肛门及生殖器等褶皱部位。吸烟、肥胖、饮酒和衣物摩擦等是该病的危险因素[3]，可伴发鳞癌、关节炎、角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征、克罗恩病等[4]。研究已经证实，约40%AI患者有家族遗传史[5]，属常染色体显性遗传，2010年Wang等[6]首次确定AI的致病基因为PSENEN、PSEN1和NCSTN。迄今，已报道至少18个AI家系及4例散发病例的22个致病突变位点[7,8]。本研究中，收集到1家系并通过全基因组外显子测序和Sanger测序确定了NCSTN基因的1个新的突变位点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究的4例AI患者来自山东省的1个反常性痤疮家系，在山东省皮肤病医院就诊，临床表现和组织病理符合AI[7]。该家系共3代13人(图1)，其中患者5例(1男4女)，在世患者4例，符合常染色体显性遗传规律。先证者，女，49岁，有34年的炎性丘疹、脓疱、脓肿和遍及背部的增生性瘢痕病史，尤其颈部较为严重(图2)。既往史和个人史无特殊，父母及家系内无近亲结婚。体格检查：一般状况良好，心肺腹未见明显异常。皮肤科检查：背部可见散在的凹陷性疤痕及条索状不规则的增生性瘢痕，颈部可见囊肿、脓肿、糜烂及渗出。先证者母亲(I2)、哥哥(II3)和侄女(III2)躯干部均与先证者有相似的临床表现，先证者侄女症状较轻，考虑可能与该患者年龄较小有关。组织学检查：送检为鳞状上皮及多量炎性肉芽组织，可见表皮角化过度、灶性角化不全，棘层增厚，真皮内胶原纤维增生，血管周围大量急慢性炎细胞浸润。

图1 家系图

图2 2a：颈部可见糜烂、渗出、脓肿及囊肿；2b、2c：背部可见凹陷性疤痕，条索状不规则的增生性瘢痕及散在分布的囊肿

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取 共收集4例AI患者，9名健康亲属及100名健康对照者的外周血5 mL。使用Biorupter(Diagenode，比利时)从外周全血DNA提取，并使用全波长紫外/可见光扫描分光光度计(NanoDrop公司，ND-8000)进行DNA含量及纯度测定。研究经山东省皮肤病医院伦理委员会批准(批准号：2014-KYKT-23)，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2.2 全基因组外显子测序 对先证者外周血DNA进行全基因组外显子测序。首先使用AIExome Enrichment Kit V4试剂盒(艾吉泰康生物科技北京有限公司)捕获完整的外显子及相邻内含子区域,后通过Illumina HiSeq 6000平台对基因组文库进行高通量、高深度测序。测序得到的原始数据经FastQC v0.11.8检测质量后，使用TRIMMOMIC v0.38软件将数据进行修剪过滤，最终筛选出来的数据通过BWA v0.7.17软件比对到hg19版本的参考基因组，比对好的数据用GATK v4.0.12.0软件进行突变位点寻找，所有的突变位点用ANNOVAR进行注释。

1.2.3 DNA测序验证突变 根据先证者全基因组外显子测序获得的致病基因上突变，对收集的其他血液DNA样本进行突变位点的Sanger测序验证。对筛选出的突变位点所在的基因序列区域进行PCR扩增，利用网页版BLAST软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计待扩增区域序列的引物序列：NCSTN-F:GGAAACACGAACTTCCGGTC，NCSTN-R: ACTTCTGTCGTGGGAACGAA，交由北京华大基因科技有限公司合成。扩增条件：94℃预变性10 min，94℃变性30 s、61℃退火45 s、72℃延伸1 min共35个循环，之后72℃延伸10 min。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳切胶纯化后，直接在ABI 3500Xl Dx Genetic Analyzer测序仪(Applied Biosystems，美国)进行测序，并运用Chromas软件与NCSTN基因参考序列进行比对。

2 结果

2.1 AI患者外显子测序分析 注释后的结果显示，该患者未在已报道致病基因PSENEN和PSEN1上携带致病突变；在AI相关致病基因NCSTN上携带突变位点c.85+2T>C，该位点位于第1号外显子与1号内含子交界处(图3)，dbscSNV软件预测该突变位点分值为0.99，提示该位点可导致剪切异常为有害变异。这一突变在四个公共数据库[dpSNP142, 1000 Genomes Project, HapMap and Exome Aggregation Consortium (ExAC, http://exac.broadinstitute. org/)]中均不存在。

2.2 Sanger测序验证突变 对家系中全部4例AI患者(I2、II3、II5、III2)、9名健康亲属(II2、II4、II6、III1、III3、III4、III5、III6、III7)以及100名健康对照者的DNA样本进行PCR扩增，通过Sanger测序对NCSTN基因的新突变进行验证。结果显示，该家系的其余3例患者均携带同一突变(NCSTN c.85+2T>C)，家系中9名健康亲属以及100名健康对照者中均未发现该突变。

3a：I2患者1号外显子与1号内含子交界处存在一个剪接位点突变c.85+2T>C；3b：II3患者1号外显子与1号内含子交界处存在一个剪接位点突变c.85+2T>C；3c：II5患者1号外显子与1号内含子交界处存在一个剪接位点突变c.85+2T>C；3d：III2患者1号外显子与1号内含子交界处存在一个剪接位点突变c.85+2T>C；3e：正常对照序列

3 讨论

反常性痤疮以聚合性痤疮、化脓性汗腺炎和头皮脓肿性穿掘性毛囊周围炎三联特征为临床表现。本家系的4例患者均具有典型的临床特征，包括：(1)典型的皮损：早期深在的痛性结节或者随后的脓肿、窦道、疤痕及簇集的黑头粉刺；(2)典型的发病部位：腋窝、腹股沟、会阴部、肛周、臀部及乳房下褶皱部位；(3)慢性和复发性，符合AI的诊断标准[9]。

目前，反常性痤疮的发病机制尚不明确，30%～40%的AI患者具有家族史，为常染色体显性遗传。2010年Wang等首先发现家族性反常性痤疮的发病与编码γ分泌酶不同亚基的基因发生功能性突变有关[6]。γ分泌酶是一个膜内切蛋白酶复合体，由 Nicastrin(NCSTN)、早老素1(PSEN1)、早老素增强子2(PSENEN)、前咽缺陷蛋白(Aph1)4个基因编码的蛋白亚基组成，这些基因发生突变造成γ分泌酶单倍体合成缺陷或不足是AI发生机制之一[10]。目前已证实NCSTN、PSEN1和PSENEN基因突变会导致AI的发生[11]，其中NCSTN基因突变占81.8%[12]。NCSTN基因位于1q23.2，包括17个外显子，是γ分泌酶最大的活性亚基，其含有高度糖基化大的细胞外结构域(extracellular domain，ECD)和单跨膜螺旋(transmembrane helice，TM)，便于识别底物蛋白N端[13]，且纳卡斯楚因蛋白参与γ分泌酶的组装、成熟及稳定，常引起AI患者NCT蛋白表达下调[14]。已有研究表明将γ分泌酶基因敲除的小鼠表现出毛囊滤泡角质化、皮脂腺萎缩以及上皮囊肿形成[15]，因此AI的发生可能通过NCSTN突变从而影响γ分泌酶的正常活性，最终造成γ分泌酶单倍体不足。不过在其他疾病中也检测出γ分泌酶基因突变，例如白血病、乳腺癌、扩张性心肌病[16]。另外，有报道[17]称AI患者中除了γ分泌酶组成成分基因突变外，还存在着启动子区域PSTP1P1变异及TNF基因多态性等。

本研究在1个AI家系的1号外显子与1号内含子交界处发现一新发剪接位点突变，即c.85+2T>C，该突变位于剪接位点处，结构域在翻译过程中起到终止作用，检索国内外文献并未发现有关此位点突变的报道。我们推测此种突变可能导致NCSTN基因编码蛋白翻译异常或表达单倍剂量不足，引起γ分泌酶正常活性，从而影响到对表皮角质形成细胞的维持及毛囊外根鞘细胞正常增殖和分化等[18]，最终导致AI的发生。本家系中四例患者携带相同的突变位点，I2、II3、II5患者的病情均较重，只有III2患者的症状较轻，可能与该患者年龄较小有关。

综上，本研究发现一个新发致病突变，在国内外为首次报道，丰富了NCSTN基因的突变谱系，有助于进一步探讨NCSTN突变与AI之间的关系，进而为今后AI的遗传咨询和基因诊断提供依据。