罗汉果土传病害拮抗真菌的筛选及其抗菌活性研究

张 泽，邓业成，陈 敢，王瑞昊，张燕玲，邓志勇，蓝福生，郭丽霞，张川梅，梁保明，骆海玉，张明良

(1.广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006； 2.桂林吉福思罗汉果有限公司，广西 桂林 541006)

罗汉果[Siraitiagrosvenorii(Swingle) C．Jeffrey]是葫芦科藤本植物[1]，被称为“东方神果”。罗汉果味甘性凉，除了具有食用价值外，还有巨大的药用价值。其在生长过程中易受白绢病[2]和根腐病[3]等土传病害的危害，造成罗汉果产量减少、质量下降。目前，作物土传病害的防治仍以传统化学药剂为主，成本高且易造成环境污染，同时也易致使农产品中农药残留超标，有违农业可持续健康发展的要求[4-6]。因此，寻找健康、对人类无害且有利于环境保护的土传病害防治方法成为目前罗汉果种植产业面临的重要问题。

国内外利用拮抗微生物进行农作物生物防治的研究已有诸多报道。刘雨等[7]研究了9种化学杀菌剂、3种植物源杀菌剂和5种微生物菌剂对白绢病菌的抑制效果，发现微生物菌剂对白绢病菌的抑制效果较为明显。杜用玺等[8]总结了黄连根腐病的发生规律以及防治措施，认为利用微生物防治可有效地降低化学防治对生态环境的破坏，更符合可持续发展的要求。拮抗微生物可通过改善土壤理化性质和营养状况促进植物生长，进而提高作物抗病能力[9-12]，也可通过改变与病原菌的竞争生态位点、激活植物防御体系、调节根系分泌物等方面[13-14]，达到有效控制病害的目的。

目前，利用拮抗微生物防治罗汉果土传病害方面的研究报道较少，仅见冯世鑫等[15]利用芽孢杆菌及其发酵产物对罗汉果白绢病菌开展拮抗活性研究及田间试验。鉴于此，从发病罗汉果果园健康植株根际土壤中分离纯化对罗汉果土传病菌有抑制作用的拮抗真菌，并对其进行鉴定，研究其发酵产物对根腐病菌及白绢病菌的抗菌活性，旨在解决该类病害危害严重、防治困难、化学防治造成农药残留等问题，为罗汉果产业的健康可持续发展提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试土传病原菌:白绢病菌(Sclerotiumrolfsii，编号为BJB)和根腐病菌(Fusariumsolani，编号为GFB)，均由广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室化学生态实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤中拮抗真菌的分离与纯化 参照袁佐清[16]、LUO等[17]的方法，对罗汉果根际土壤中拮抗真菌进行分离纯化。首先称取10 g土壤样品，装入已灭菌的三角瓶中，加入100 mL无菌水，用恒温摇床充分振荡20 min。待振荡完毕，将制备好的土壤悬浮液在超净工作台上经0.5 μm滤膜过滤后，用移液枪吸取1 mL到装有9 mL无菌水的试管中，充分振荡后即为质量浓度10 mg/mL土壤悬浮液，从中吸取1 mL到另一支装有9 mL无菌水试管中，以此类推，制备出质量浓度为1、0.1、0.01 mg/mL的土壤悬浮液。

在超净工作台中使用移液枪分别吸取各质量浓度的土壤悬浮液1 mL，采用涂布平板法接种在马丁氏培养基上，每个质量浓度3皿重复，27 ℃恒温倒置培养72 h。将不同形态的菌落单独转接到PDA培养基上，27 ℃恒温倒置培养，不断重复此操作，直至长出单一菌落形态。

1.2.2 拮抗真菌对罗汉果病原真菌的拮抗活性测定 采用平板对峙法。将已分离纯化的菌株和根腐病菌株及白绢病菌株在恒温28 ℃条件下培养72 h后，分别在其菌落边缘打0.4 cm的菌饼，将病原菌和拮抗菌的菌饼接种在以培养皿中心点为中心向两端延伸1 cm的位置上，其菌饼间距为2 cm，对照组将单独的病原菌接种在培养皿中心，28 ℃条件下培养72 h后，采用十字交叉法测量菌落生长直径，取平均值，计算抑菌率。

抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)÷(对照菌落直径-0.4)×100%。

1.2.3 拮抗菌的鉴定 将已分离纯化的拮抗真菌菌株在PDA培养基中27 ℃恒温倒置培养72 h，观察其菌落形态(包括其菌落大小、形态、颜色等)，并结合光学显微镜进行形态学鉴定。然后，委托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行18S rDNA测序分析，将获得的测序结果在NCBI的GenBank数据库中进行Blast比对,并采用MEGA 6.0软件进行多序列同源性分析,最终利用其构建系统发育树。

1.2.4 拮抗菌发酵培养及粗提物制备 发酵培养采用液体PDB发酵和固体大米发酵2种方式[18]。液体发酵选择的培养基为PDB液体培养基，将已经活化好的拮抗菌在无菌操作台中用直径为0.4 cm的打孔器在菌落边缘打孔，取4块菌饼接种至含有PDB培养基(400 mL)的锥形瓶(1 000 mL)中,放置恒温箱中(27 ℃)静置培养45 d。发酵液使用抽滤瓶重复抽滤2次即得到纯净发酵液和滤渣，将纯净发酵液使用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取3次后得到乙酸乙酯萃取物和萃余物，使用旋转蒸发仪分别蒸干溶剂，即得到乙酸乙酯萃取物和萃余物。将其滤渣放入60 ℃烘箱中烘干水分，粉碎后使用甲醇浸泡(m滤渣∶V甲醇=1∶4)3 d，提取3次，合并滤液进行浓缩蒸干，即得到甲醇提取物。

固体大米发酵即在无菌操作台中用直径0.4 cm的打孔器在病原菌菌落边缘处打孔，取3块菌饼接种至含有PDB培养基(150 mL)的锥形瓶(250 mL)中,置于恒温摇床上(27±1) ℃、150 r/min条件下振荡培养。培养5 d后即可得到发酵种子液。取5 mL种子液接种于事先准备好的大米培养基(大米∶水=1∶1)中,放置培养箱中27 ℃恒温培养60 d。将发酵产物进行干燥、粉碎处理后,用适量的乙酸乙酯分别浸泡提取3次,将提取滤液用旋转蒸发仪浓缩蒸干,即为发酵产物。

1.2.5 拮抗菌发酵产物对罗汉果病原真菌的抑菌活性测定 采用菌丝生长速率法[19]测定不同发酵方式不同有机溶剂萃取得到的发酵产物对根腐病菌及白绢病菌的抑菌活性。具体操作步骤：将粗提物样品用丙酮溶解配成药液，共设置10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 mg/mL 5个质量浓度梯度，将配制好的药液(对照用等量丙酮代替)与PDA培养基[(60±5)℃]按1∶9混合均匀后倒入直径为9 cm的培养皿待其冷却，在每皿中央放置一块直径为0.4 cm的病原真菌菌饼，菌饼长满菌丝面朝下紧贴在培养基表面，每个质量浓度重复3皿。置于培养箱中27 ℃倒置培养72 h，采用十字交叉法测量菌落生长直径，取平均值，计算抑菌率。抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。根据抑菌率测定其对罗汉果根腐病菌和白绢病菌的毒力大小，用最小二乘法求出毒力回归方程及EC50等。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18软件对试验数据进行统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 25株土壤拮抗真菌对2种罗汉果病原真菌的拮抗活性

通过平板稀释涂布法从土样中分离出25株真菌。由表1可见，采用平板对峙法筛选出对罗汉果根腐病菌抑菌活性较好(抑菌率为42.01%～63.56%)的拮抗真菌4株，分别为TYM-3-1、TYM-3-3、TYM-3-8和TYM-4-4；对罗汉果白绢病菌抑菌活性较好(抑菌率为59.81%～74.17%)的拮抗真菌3株，分别为TYM-3-1、TYM-3-3和TYM-3-8(表1)。

表1 25株土壤真菌对罗汉果根腐病菌和白绢病菌的抑制作用

2.2 土壤拮抗真菌的鉴定

4株抑菌活性较显著的拮抗真菌的菌落形态见图1。TYM-3-1菌落呈同心环状，并产生稠密的分生孢子，菌落外边缘为白色，内侧2～3个同心圆呈暗绿色，菌落背面呈白色，生长速度快。TYM-3-3在PDA平板上27 ℃恒温培养72 h后，菌落表面呈黑绿色毡状，边缘呈白色，表面疏松有干粉，背面呈暗褐色，菌落生长迅速，大小为1～2 cm小菌落，表面疏松。TYM-3-8在PDA平板上27 ℃恒温培养72 h后菌落中间呈灰绿色，边缘呈白色，菌落形态呈毡状，表面为絮状，有放射状褶裂。TYM-4-4菌落生长较慢，质地絮状，菌丝体颜色由白色、淡黄色、粉红色至淡红色；渗出液成微滴，黄白色，背面由无色转为黄色最终为橙红色。将TYM-3-1、TYM-3-3、TYM-3-8和TYM-4-4的测序结果在NCBI的GenBank数据库中进行Blast比对，并采用MEGA 6.0软件进行多序列同源性分析，最终构建系统发育树(图2)。结合菌落形态学特征，4株拮抗真菌鉴定结果为，TYM-3-1为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，TYM-3-3为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)，TYM-3-8为篮状菌(Talaromycesangelicus)，TYM-4-4为微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)。

2.3 4株拮抗真菌液体发酵产物对罗汉果根腐病菌和白绢病菌的抑菌活性

采用菌丝生长速率法测定了液体发酵拮抗真菌得到的乙酸乙酯萃取物、萃余物及甲醇浸泡菌丝体得到的发酵产物对根腐病菌和白绢病菌的抗菌活性。由表2可知，不同拮抗真菌的不同有机溶剂萃取物对根腐病菌及白绢病菌表现出不同的抗菌活性。TYM-3-1、TYM-3-3、TYM-3-8的乙酸乙酯萃取物对根腐病菌均表现出最高的抗菌活性，EC50值分别为1.290 1、2.637 0、3.646 9 mg/mL，其中TYM-3-1乙酸乙酯萃取物对根腐病菌具有最高的毒力；TYM-3-3、TYM-3-8、TYM-4-4的乙酸乙酯萃取物对白绢病菌均表现出较好的抗菌活性，EC50值分别为1.740 4、3.925 1、0.636 2 mg/mL，其中TYM-4-4乙酸乙酯层萃取物对白绢病菌具有最高的毒力。以上表明，TYM-3-1对根腐病菌具有较强的抑制作用，TYM-4-4对白绢病菌具有较强的抑制作用。此外，由表4还可以看出，乙酸乙酯萃取物对2种病原菌的抑制活性优于萃余物和菌丝体甲醇提取物，即4株拮抗真菌拮抗根腐病菌及白绢病菌的活性成分主要集中在乙酸乙酯层。

表2 4株拮抗真菌液体发酵产物对根腐病菌及白绢病菌菌丝的毒力

2.4 4株拮抗真菌大米固体发酵产物对罗汉果根腐病菌和白绢病菌的抑菌活性

为进一步探究4株土壤拮抗真菌对罗汉果根腐病菌和白绢病菌的抑制活性，采用菌丝生长速率法测定4株真菌大米发酵产物粗提物对根腐病菌及白绢病菌的抑制活性，结果见表3。TYM-3-1对根腐病菌、白绢病菌均具有较强的毒力，EC50值分别为2.339 4、1.941 8 mg/mL，均小于2.5 mg/mL。

表3 4株拮抗真菌大米固体发酵粗提物对根腐病及白绢病菌菌丝的毒力

3 结论与讨论

本研究从罗汉果根际土壤分离、筛选、鉴定拮抗真菌，并探究了其对罗汉果土传根腐病菌和白绢病菌的拮抗活性。结果表明，从罗汉果根际土壤中筛选出4株对罗汉果根腐病菌抑菌活性较好(抑菌率为42.01%～63.56%)的拮抗真菌，结合形态学和分子生物学方法进行鉴定，分别为棘孢木霉、棘孢曲霉、篮状菌和微紫青霉。目前，棘孢木霉制剂在防治农作物土传病害方面效果显著[20]；微紫青霉生物活性的研究已有相关报道[21]，但其对罗汉果土传病害的防治效果尚无报道；关于棘孢曲霉和篮状菌对罗汉果土传病害的影响尚未见报道。

对拮抗真菌液体发酵产物粗提物的抗菌活性研究发现，该4种真菌粗提物对根腐病菌和白绢病菌均具有不同程度的抑制作用，且至少有1种萃取物具有良好的抗菌活性。其中，TYM-3-1乙酸乙酯萃取物对根腐病菌具有较好的毒力，其EC50值为1.290 1 mg/mL，TYM-4-4乙酸乙酯萃取物对白绢病菌具有较好的毒力，其EC50值为0.636 2 mg/mL。可见，棘孢木霉对根腐病菌表现出明显的抗菌活性，微紫青霉对白绢病菌具有明显的抑菌活性，其活性成分主要集中在乙酸乙酯层。此外，拮抗真菌大米固体发酵得到的发酵产物对2种病原菌的毒力测定结果表明，棘孢木霉菌对根腐病菌、白绢病菌均表现出明显的抗菌活性，其EC50值分别为2.339 4、1.941 8 mg/mL。对比2种发酵方式得到的发酵产物抗菌活性，液体发酵得到的发酵产物对2种病原菌的抗菌活性较强。本研究结果表明，健康罗汉果根际土壤中具有丰富的真菌资源，且发酵产物中活性物质表现出明显抗根腐病菌及白绢病菌活性。

综上，从罗汉果根际土壤中分离得到棘孢木霉菌、棘孢曲霉菌、篮状菌和微紫青霉菌，对罗汉果根腐病菌及白绢病菌均表现出明显的抑制作用。其中，棘孢木霉菌对根腐病菌表现出明显的抗菌活性，微紫青霉菌对白绢病菌具有明显的抑菌活性。本研究为研制有效的生物源菌剂，解决目前罗汉果土传病害危害严重、防治困难以及因化学防治造成的罗汉果产品农药残留问题提供了重要资源。