PCR法分析市售牛肉类制品成分现状

邹寒艳 王莹 尚亚宁 张恩

牛肉制品由于营养丰富、价格高昂，成为不法商贩获取非法利润的对象。近些年不断有媒体报道牛肉制品的掺假事件，牛肉制品质量的良莠不齐，尤其是动物源性成分的掺假和造假，对消费者的生活造成了一定的影响。面对真假难辨的牛肉制品，老百姓仅用感官与经验等传统的食品鉴别方法无法区分真假牛肉和掺假牛肉，如何鉴别肉类及其制品是否掺假已成为食品安全监管和检测机构迫切需要解决的问题。

针对肉制品掺假和冒充等问题，长期以来，解剖学、组织学、显微镜学、感官学、化学、电泳、色谱、免疫学等方法均在肉类鉴定中发挥着作用。但这些技术存在特异性差、准确性低和成本高等问题，存在固有的局限性。目前，食品中动物源性成分鉴定主要是运用以DNA为基础的PCR技术，因为DNA在各种加工过程中很稳定，并且不同动物的DNA具有唯一性，因此以DNA为基础开发的PCR技术，以其灵敏性高、准确性好和效率高等优点而得到广泛的应用。

近些年陆续出台了大量以PCR技术为核心的动物源性成分鉴定行业标准和国家标准。本文应用PCR技术，对从超市、农贸市场和小摊贩处随机购买的145批牛肉制品进行动物源性成分真伪调查分析，参考的标准是中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2051-2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法》、SN/T 2978-2011《动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法》、SN/T 3731.5-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5部分：鸭成分检测PCR法》、SN/T 3730.5-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分：马成分检测实时荧光PCR法》、SN/T 3730.4-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法》。结果发现，卤牛肉、生牛肉均检出牛源性成分；袋装和散装牛肉干中分别有1批次和6批次检出非牛源性成分。这说明市售牛肉制品存在非牛源性成分掺假的情况，尤其是散装牛肉干制品，后续应加强对农贸市场和小摊贩的监督管理。

一、材料与仪器

1.材料。从市场上选取不同类型的牛肉制品。卤牛肉来源于超市、农贸市场、小摊贩，包装形式为散装，共10批。牛肉干来源于农贸市场、小摊贩，包装形式为散装，共80批；牛肉干来源于超市，包装形式为袋装，共40批。生牛肉来源于超市，包装形式为袋装，共5批；生牛肉来源于超市，包装形式为散装，共10批。

2.试剂。DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，实时荧光PCR检测试剂 盒，牛源性成分检测试剂盒，羊源性成分检测试剂盒，猪源性成分检测试剂盒，均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；PCR试剂2xGold easy Mix，购自天根生化科技有限公司，引物序列均为华大基因合成。

3.主要仪器。Lightcycler 480II荧光定量PCR仪，美国Roche公司；Tprofessional梯度PCR仪，德国Biometra公司；核酸微量分析仪，美国Thermo公司；Mupid-2 Plus通用电泳仪，日本Mupid公司。

二、实验与结果

1.牛肉制品的DNA提取。利用DNA提取试剂盒提取牛肉制品的DNA，鉴于牛肉干加工过程较为复杂的情况，在前处理过程中，将牛肉干放入温水中去除油脂、佐料和盐分，并对难以提取的样品延长56℃的水浴时间。在清洗牛肉干时使用灭过菌的器具，避免交叉污染。DNA提取质量（260/280）均在1.7-2.0，浓度是10-200ng/μL，均符合后续PCR扩增需要。

2.卤牛肉的检测结果。对十批卤牛肉进行牛源性成分检测，实时荧光PCR的CT值均在15-25之间，依据标准，这十批卤牛肉均含有牛源性成分。进行其它成分检测时，不含有其他动物源性成分。

3.牛肉干的检测结果。牛肉干袋装和散装制品分别进行动物源性成分（牛源性、猪源性、鸭源性、鸡源性、马源性和驴源性成分）检测，结果发现，袋装和散装牛肉干分别有1批和6批未检出牛源性成分，1批检出牛源性成分的袋装牛肉干中检出了猪源性成分，2批检出牛源性成分的散装牛肉干中检出了猪源性成分。

4.生牛肉的检测结果。对15批生牛肉进行检测分析，结果发现，不论袋装还是散装的制品均含有牛源性成分。进行其它成分检测，不含有其它动物源性成分。

三、讨论

对市场上的牛肉制品进行调查分析后发现，仍存在以假乱真、以次充好的现象。从检测结果中可以看出，感官可以直接观察的牛肉制品在本次调查中未发现掺假制品，而在牛肉干中无论是袋装还是散装均发现掺假现象，其中散装牛肉干制品中出现直接用猪肉冒充牛肉的数量最多。经过来源分析发现，农贸市场和小摊贩出现问题制品的现象更多。

从本次分析数据中可以看出，未来市场监管部门应当重点监管的牛肉制品是多道工序加工的牛肉干，并可将售卖牛肉干的农贸市场和小摊贩作为抽查重点，也可联合公安部门对生产劣质掺假牛肉制品的黑作坊进行依法查处。

近年来，以DNA为基础的PCR技术广泛地被用来鉴定食品中的动物源性成分，由于PCR方法比较简便，特异性和灵敏度都很高，国内外已经运用该技术和其他技术结合建立了多种鉴别动物源性成分的方法。在实际检测过程中，DNA质量的好坏也会影响PCR结果的准确性，传统的 SDS法、CTAB法、Chelex-100法在提取深加工食品时均存在一定的局限性。本实验中使用的是Takara的全基因组DNA提取试剂盒，結合对深加工样品油脂和盐分的冲洗，提取出来的DNA质量均在1.7-2.0之间，完全可以满足PCR检测使用。因此建议在提取深加工肉类制品时使用商业试剂盒，可以节省人力和时间，提高检测效率。

随着PCR方法在肉类制品成分鉴别上的广泛应用，在实际操作中发现仅依靠CT值的大小来判断某些复杂样品是否含有某种动物源性成分较为困难，给检验增加了大量的工作，比如需要多次更换取样部位、多次提取DNA、多次PCR实验等。因此，亟需新技术的突破。

近几年，随着数字PCR技术的不断发展，不少学者已经将该技术应用到动物源性成分的鉴别上，为肉制品成分鉴定和掺伪提供了更有利的帮助。相信随着技术的不断发展，肉制品动物源性成分方面的掺假造假会越来越少，老百姓也会享受到更高质量的肉制品。

作者简介：邹寒艳，博士，工程师；研究方向：食品药品检测。

*通信作者：张恩，博士，高级工程师。