禽类中沙门氏菌MLST分型及毒力基因筛查

张捷，畅晓晖，柳明，李小林，万晓楠，槐硕，赵琢*

（1.中国海关科学技术研究中心，北京100026;2.出入境食品安全检测北京市重点实验室，北京100026；3.天津海关工业产品安全技术中心，天津300308）

根据世界卫生组织的估计，全球每年大约有10亿人发生食源性疾病，其中由食源性致病菌引起的食品安全事件，造成全球每年约349亿美元的经济损失。沙门氏菌病是欧盟继弯曲杆菌病之后第二种常见的食源性疾病，是食源性疾病暴发的重要原因[1-2]。

传统的沙门氏菌检测分型，多采用血清学分型，而定量检测无法准确分析其主要基因型及变化情况，难以满足实际的预防检测要求。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）是一种新兴的分子流行病学工具[3-4]。最近的研究表明，致病菌分型可以使用WGS积累的大量DNA序列数据区分非常密切相关的分离株，远远超过脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和多位点可变数目串联重复序列分型（multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）[3]。 此外，WGS可以识别分离株组之间特定分子的差异，从而可以鉴定系统发育树上的特征，以显示菌群之间的进化关系。本研究采用快速的全基因组测序分型和多位点序列测定分型（multilocus sequence typing，MLST）方法。该方法可直接进行沙门氏菌主要基因型的检测，缩短了沙门氏菌基因型的排查时间。经过软件分析可对其亲缘关系进行分析鉴定，是一种适用性较强的检测方法。本研究对前期分离鉴定的36株沙门氏菌进行全基因组测序、MLST分型及毒力基因筛查，比较不同来源沙门氏菌的基因型及毒力基因分布情况，从而为食源性致病菌沙门氏菌的风险识别和溯源提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 菌株

36株不同来源的沙门氏菌由中国海关科学技术研究中心分离、鉴定保存；参考菌株：肠炎沙门氏菌ATCC9184、伤寒沙门氏菌ATCC50071（美国ATCC菌种保藏中心）均由中国海关科学技术研究中心保存。

1.2 试剂

亚硒酸盐胱氨酸（selenite cystine broth，SC）增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆盐（xylose lysine desoxycholate，XLD）琼脂：赛默飞世尔科技公司；显色培养基：上海欣中生物工程有限公司；DNA提取试剂盒：宝生物工程有限公司。

1.3 DNA完整性检测

把38个提取好的DNA样品放在冰上融化后，吹打混匀离心待检测。采用琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1%、电压150 V、电泳时间40 min）检测样品的完整性，用于构建DNA文库。

1.4 全基因组测序

细菌基因组de novo测序。采用illumina平台对36株沙门氏菌进行测序。用检测合格的样品构建文库，最后用合格的文库进行集群cluster制备和测序。

1.5 MLST分型

根据全基因组测序结果分析7个管家基因（aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、suc A、thrA），每株菌的 7 个位点组合获得一个ST型。然后通过Eburst（http：//eburst.mlst.net）对沙门氏菌分离株进行亲缘关系分析。

1.6 沙门氏菌毒力基因筛查

采用毒力因子数据库（virulence factors database，VFDB）对毒力岛（Salmonella pathogenicity islands，SPI）基因包括 sopE、sptB、sseA/B/C/D、mgtC、sopB、sopD、soxR等基因及侵袭基因invA/invF、细胞致死膨胀素基因cdtB、毒力基因spvB等进行分析。

1.7 沙门氏菌聚类分析及数据处理

基于全基因组序列构建系统进化树。系统发生树（phylogenetic tree）是表明被认为具有共同祖先的各物种相互间演化关系的树。它用来表示系统发生研究的结果，用它描述物种之间的进化关系。基于SNP结果进行进化分析并构建最大似然法进化树。采用MEGA7.0软件制作系统进化树。

2 结果与分析

2.1 DNA完整性检测

样品前处理：将提取好的36个菌株的DNA样品在冰上融化后，充分混匀并离心，取适量样品进行检测。检测参数：胶浓度1%；电泳150 V；电泳时间40 min。图1为电泳检测图谱（以1号～16号菌株DNA样品为例）。

图1 琼脂糖凝胶电泳图谱检测DNAFig.1 Detection of DNA by agarose gel electrophoresis

采用DNA Marker作对照，确定样品的相对分子量。DNA如果降解或者混有其它杂质如蛋白质、RNA，则可以通过电泳检测。36个DNA样品的完整性使用琼脂糖凝胶电泳法检测，所有检测条带均位于同一位置23 130 bp。因此，所有DNA样品均合格，并可用于构建DNA文库。

2.2 沙门氏菌MLST分型结果

36株沙门氏菌MLST分型结果见表1。

由表1可知，共获得11个ST型，其中获得优势的ST型为ST11，有17株占47.2%，其次为ST19，有8株占22.2%。其中ST11与ST78标准菌株的7个管家基因中，5个基因完全相同，亲缘关系较近，均为肠炎沙门氏菌；ST19与ST34的7个管家基因中，5个基因完全相同，亲缘关系较近，均为鼠伤寒沙门氏菌。

表1 36株沙门氏菌MLST分型结果Table 1 36 strains of Salmonella MLST typing results

2.3 毒力基因分析

基于全基因组测序结果，采用毒力因子数据库对毒力岛（Salmonella pathogenicity islands，SPI）基因包括sopE、sptB、sseA/B/C/D、mgtC、sopB、sopD、soxR、侵袭基因invA/invF、细胞致死膨胀素基因cdtB、毒力基因spvB等进行分析见表2。

表2 36株沙门氏菌毒力基因分析Table 2 Analysis of virulence genes of 36 strains of Salmonella 株

将36株沙门氏菌进行全基因组重测序，选用VFDB数据库对菌株毒力岛（Salmonella pathogenicity islands，SPI）SPI-1、SPI-2、 SPI-3、 SPI-4、SPI-5 进行分析，发现除sopE、sopE2外其余致病岛基因均为保守基因。 88.2%（15/17）肠炎沙门氏菌携带sopE，69.2%（9/13）鼠伤寒氏菌携带sopE。肠炎沙门氏菌中88.2%（15/17）的菌株携带sopE2，鼠伤寒沙门氏菌中92.3%（12/13）的菌株携带sopE2。研究表明沙门氏菌的致病性与毒力基因相关，包括菌毛黏附类因子、调节因子、毒力岛、质粒上的毒性基因、毒素等[5-6]。感染初期沙门氏菌入侵肠上皮细胞是由毒力岛SPI-1控制的。SPI-2Ⅲ型分泌系统编码sseL使细菌在体内持续慢性感染，它通过阻止宿主细胞中的免疫细胞迁移，减弱宿主清除细菌的能力[7-9]。 SPI-3的基因mgtC与宿主吞噬细胞的毒力相关[10]。除了染色体上的毒力基因，毒力质粒上的代表基因主要是spvB和pefA[4，11]。prot6E一般位于肠炎沙门氏菌质粒中，pefA可促进细菌吸附于肠上皮细胞，与菌毛形成有关[12-15]。

本研究中36株沙门氏菌均携带有SPI1～SPI5代表性基因和调节基因，它们是沙门氏菌具有高致病力的分子基础。该菌重要的致病因子鞭毛蛋白由fliC或fliB编码，可引起强烈的免疫应答。hisH为组氨酸转运基底结合蛋白，可使组氨酸降解成氨，影响组氨酸的合成。36株沙门菌株中，66.7%（24/36）菌株含有毒性质粒spvB基因。肠炎沙门氏菌携带spvB高达82.4%（14/17）、鼠伤寒沙门氏菌携带spvB的菌株占76.9%（10/13）。本次分离到的胥伐成格隆沙门菌为多克隆ST241型，占5.56%（2/36）。胥伐成格隆沙门菌与肠炎沙门氏菌明显不同，两株胥伐成格隆沙门菌均未携带质粒毒力基因spvB、pefA、prot6E，反映出基因型差别对携带毒力基因的影响。在我国胥伐成格隆沙门菌携带毒力基因的研究比较少见。有些毒力因子可以直接产生毒素，如细胞致死膨胀毒素（cytolethal distending toxin B，CdtB）。 百日咳类毒素（pertussis-like toxins，PltA）在胥伐成格隆沙门氏菌中普遍存在。CdtB、PltA经NCBI Blast比对，与伤寒沙门氏菌的相应基因（S.typhi CT18）DNA相似性达97%以上。

2.4 沙门氏菌分离株聚类分析

采用全基因组测序分型方法对36株沙门氏菌分离株进行聚类分析，将所有菌株的基因组序列与参考菌株基因组序列进行比对分析，获得单核苷酸多态性包括3 005个基因为核心基因，共聚成9类。沙门氏菌分离株聚类分析图见图2。

图2 沙门氏菌分离株聚类分析图Fig.2 Cluster analysis of Salmonella isolates

肠炎沙门氏菌检测率较多的样品主要集中在禽肉、猪肉和牛肉。本研究中肠炎沙门氏菌均来源于禽肉包括鸡源、鸭源。由图2可知，肠炎沙门氏菌聚在一类，包括菌株 1、4、5、6、12、13、22、28 等。鼠伤寒沙门氏菌聚在一类，包括 3、7、8、23、25、33、31、35。菌株 2、27号聚在一起，均为胥伐成格隆沙门氏菌。通过聚类图分析，全基因组分型将沙门氏菌分成9簇，相同的血清型可能分在同一个簇。如2株胥伐成格隆沙门菌，基因型具有高度的相似性。10株鼠伤寒沙门氏菌分在不同的2个簇里，可能是由于不同品种肉类（鸡源、鸭源）的沙门氏菌在进化上产生了变异。2株胥伐成格隆沙门氏菌聚在一起，均从鸡大胸中分离产生。

3 讨论与结论

通过对2017年北京地区禽类中分离的36株沙门氏菌进行分型研究，发现不同来源菌株的毒力、耐药、致病性等方面均有存在差异，进一步揭示沙门氏菌的分布特征。采用MLST分型法，获得11个ST型，其中鸡源ST11肠炎沙门氏菌为优势菌株；鸭源ST19鼠伤寒沙门氏菌为优势菌株。印第安纳沙门氏菌为ST17型、胥伐成格隆沙门菌为ST241型。同时通过全基因组测序发现几株国内未报道过的沙门氏菌，MLST分型分别是 ST1941、ST2441、ST1546。

非伤寒沙门菌（non-typhoid Salmonella，NTS）中，肠炎血清型和鼠伤寒血清型引起的感染和暴发最为常见，胥伐成格隆血清型原本很少见，但近些年来很多国家发现该血清型在临床患者和食源性动物中的分离率明显上升。细胞致死膨胀毒素亦出现在此非伤寒沙门菌血清型。在沙门氏菌中，cdtB、pltA、pltB基因编码组成细胞膨胀毒素。国内外研究表明细胞致死膨胀毒素CdtA和CdtC在部分沙门氏菌亚种中会缺失，百日咳类毒素PltA和PltB将代替其发挥作用[16-18]。本研究发现cdtB、pltA基因在2株胥伐成格隆沙门氏菌中均为阳性，因此推测在胥伐成格隆沙门氏菌普遍携带细胞致死膨胀毒素。本次分离到的胥伐成格隆沙门氏菌均为多克隆ST241型，与刘晓霞等从肠道腹泻病人标本中分离的16株胥伐成格隆沙门菌MLST分型一致[19]。但均未携带质粒毒力基因spvB、pefA、prot6B。可见胥伐成格隆沙门菌基因型与鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌明显不同，反映出基因型差别对携带毒力基因的影响。在非伤寒沙门氏菌中，近年来数据显示该血清型已经在许多国家成为引起食源性疾病的主要病原菌之一[20]，结合前期耐药性试验结果，该血清型具有多重耐药性。

综上所述，通过对36株沙门氏菌进行全基因组测序、MLST分型及毒力基因筛查，比较不同来源菌株的基因型及毒力基因分布情况，需要警惕多重耐药胥伐成格隆沙门菌等对禽肉制品的感染，该菌在我国具有潜在的上升趋势和被低估的可能。进一步推测胥伐成格隆沙门氏菌可能在全球范围内传播，提示相关部门需加强进口禽肉制品的监控力度。考虑本研究涉及的区域较小、时间尚短，因此建议在我国更大范围内持续开展相关监测和研究，为我国禽类致病性沙门氏菌的防治提供了一定的理论基础和科学依据。