润燥活血汤对干燥综合征模型小鼠血清及颌下腺M3R 表达的影响

张丹娜 叶丽红 刘喜德

干燥综合征（sjogren's syndrome，SS）是一种以外分泌腺受损为主的慢性炎症性自身免疫病，以口干、眼干、关节疼痛为主要临床表现，亦可造成血液、肾、肺等全身各系统受损，甚至危及生命[1]。毒蕈碱样乙酰胆碱3 型受体（muscarinic acethyleholine receptor 3，M3R）主要分布于外分泌腺及平滑肌，阻断乙酰胆碱能神经信号的有效传递，损伤颌下腺和减少唾液输出量，造成涎腺分泌减少，从而引起口干眼干等SS症状。国内外多项研究证实，M3R 参与SS 的发病[2]。笔者临床观察发现，应用中医润燥活血汤治疗SS，可明显缓解患者口干、眼干等临床表现。本研究探讨润燥活血汤对SS 模型小鼠血清及颌下腺M3R 表达的影响及作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 8 周龄SPF 级健康BALB/c 雄性小鼠47 只，体质量（25.0±2.0）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[SCXK（沪）2017-0005]。温度（20±2）℃，相对湿度50%～60%，光照12h 明暗交替，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心清洁级小鼠实验室[动物实验条件合格证号：SYXK（浙）2013-0184；动物实验设施使用许可证编号：2015071]。

1.2 药 物（1）润燥活血汤（麦冬15g，生地10g，赤芍、丹参各9g，桃仁6g，玄参、白芍各9g，紫苑6g，生甘草3g）中药饮片与水以1∶7 的比例混合，浸泡2h，煮沸30min，过滤，药渣与水以1∶5 的比例混合，继续煎煮20min，过滤，合并2 次滤液，于水浴锅上浓缩成每毫升含生药1g 的药液，由浙江省中西医结合医院制剂室提供煎药制剂。（2）羟氯喹（HCQ）混悬液：将硫酸羟氯喹片（Sanofi-Synthelabo Ltd，批号H20090258，规格：200mg/片，碾磨成粉剂，与生理盐水按1.5mg/mL 的药物浓度配制成混悬液[3-4]。

1.3 试剂与仪器 弗氏不完全佐剂（Sigma，IFA）（Chondrex 公司提供，批号232-455-8）；小鼠血清M3R 试剂盒（Mouse M3R ELISA Kit）（厦门慧嘉生物科技有限公司，产品编号MG3782）；吸附无细胞百白破联合疫苗（武汉生物制品研究所有限责任公司，国药准字S19980016）；PBS 磷酸盐缓冲液、4%多聚甲醛、水合氯醛、二甲苯、95%乙醇、无水乙醇（浙江省中西医结合医院制剂室，批号20161008、20161017、20161014、1610113602、20161002、20160918）；一 抗（Chrm3 Polyclonal Anti-body，Mouse）、二抗（抗兔生物素化二抗）和兔免疫组化试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司，批号4ab010986、FXP020-060、FXP020-060。BIOTEK 酶标仪，美国BIOTEK 公司，规格：Power WaveXS+洗板机ELX50；TQZ312 台式全温振荡器、BMJ-B 型包埋机和DNP-9162E 电热恒温培养箱，均购自上海精宏试验设备有限公司；4℃低温离心机，德国，规格：EPPENDORF 543OR；CM1950 冷冻切片机和LEICA HI1210 捞片机，均为德国LEICA 公司；OLYMPUS BX50 显微摄像系统，日本OLYMPUS 公司；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：BT125D；-20℃科龙BCD-246AK3 低温冰箱，广东科龙电器股份有限公司。

2 实验方法

2.1 模型建立与分组 SPF 级健康8 周龄BALB/c小鼠47 只，适应性喂养7 天，按随机区组法，随机选取5 只处死摘取颌下腺，余下的小鼠随机分为正常组10 只，模型组32 只。参照文献[5]的造模方法。在低温条件下，按照脱颈椎处死法，先用75%乙醇浸泡5 只BALB/c 小鼠10min，然后在无菌工作台上解剖颈部，先取出小鼠两侧颌下腺，将包膜和结缔组织等附着物分离出来，生理盐水漂洗干净后，用无菌滤纸吸干腺体，然后称出0.1g 腺体，用显微剪剪碎，将碎块置入10mL 无菌试管中，加入2mL 生理盐水，按3000r/min 浆速，在冰浴中用匀浆器将其匀浆30s，然后在4℃低温离心机中以3000r/min 速度离心，持续15min，将试管中上层脂质吸除，余下的上清液置入10mL 无菌试管中作为抗原备用。用PBS 缓冲液将上述制备抗原稀释到100μg/mL，加入同体积弗氏完全佐剂，调配成浓度为200μg/mL 的注射用抗原。随机在32 只小鼠背部取多点注射，每只小鼠注射总量为1mL。同时各小鼠背部注射百白破联合疫苗0.05mL进行造模。10 只正常组小鼠背部随机多点注射等体积生理盐水。5 周后，随机处死2 只造模小鼠，若小鼠颌下腺有特征性淋巴细胞浸润或腺体萎缩等SS 典型病理表现，证实造模成功。将造模成功的另30 只小鼠采用随机数字表法分为HCQ 组、润燥活血汤组、模型组，每组10 只。

2.2 给药方法 根据小鼠的平均体质量25g，按照实验动物与人体每公斤体质量剂量换算比例算出用药剂量。临床成人HCQ 用量为400mg·60kg-1·d-1，临床成人中药干重用量为76g·60kg-1·d-1。模型组每次灌胃1mL 生理盐水；HCQ 组按浓度为1.5mg/mL 的HCQ 混悬液灌胃，用量为0.06g·kg-1·d-1；润燥活血汤组以润燥活血汤煎剂灌胃，用量为11.4g·kg-1·d-1。以上造模小鼠灌胃均每天1 次，连续灌胃30 天。正常组小鼠给予正常饮食，无特殊处理。

2.3 标本处理 给药30 天后，所有小鼠眼眶取血后脱颈椎处死。在4℃的温度下，按3000r/min 离心15min，吸取血清5mL，放入离心管中。并将所有小鼠颌下腺、脾脏取出，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，厚度2μm，苏木素-伊红（HE）染色。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 唾液量 每14 天测定唾液分泌量变化。计算方法：测定前做好棉球称干重，重量范围4.5～5.0mg。测唾液分泌时将已经称好干重的棉球放入实验小鼠口颊内，5min 后取出，电子天平上称湿重。唾液分泌量（mg）=湿重－干重。

2.4.2 病理形态学观察及评价 用眼科剪取下所有小鼠颌下腺，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，厚度2μm，HE 染色，光镜下观察照相。参照Cutler[3]方法，进行淋巴细胞浸润情况病理形态学评价：（1）偶见淋巴细胞浸润，0 分；（2）少量散在淋巴细胞浸润，1 分；（3）淋巴细胞中度浸润（未成灶），伴有轻度实质损伤，2 分；（4）偶见0～1 个淋巴细胞浸润灶/5个低倍视野，伴有中度实质损伤，3 分；（5）2～3 个淋巴细胞浸润灶/5 个低倍视野，伴有重度实质损伤，4分；>2 分为发病。

2.4.3 ELISA 法测定小鼠血清M3R 水平 包被过程（同时设置空白对照，阴性对照）：将抗原用包被稀释液稀释到适当浓度入孔，置37℃，4h，弃去孔中液体；封闭酶标反应孔：按试剂盒操作步骤；加入离心稀释后的小鼠血清；加入酶标抗体并洗涤；加入底物液；终止反应；结果判断。

2.4.4 免疫组化法检测小鼠颌下腺M3R 表达（1）脱蜡、水化：为防脱片，行免疫组化检验的切片需在65.0℃烤箱过夜。二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡10min，无水乙醇、95%和75%乙醇各浸泡5min，然后蒸馏水洗5min。再以磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡10min，3%过氧化氢-甲醇溶液37.0℃温育10min。纯化水冲洗，PBS 浸泡5min。（2）抗原修复：将切片置于浓度为1mol/L、pH 为6.00 的枸橼酸液修复液中，煮沸15min。自然冷却30min。用PBS 洗3 次，每次2min。（3）血清封闭：室温下，组织切片上滴加10%山羊血清封闭液，置于37.0℃湿盒，孵育10min，甩去多余液体，每片滴加1∶500 的一抗100μL，再37.0℃湿盒孵育60min。阴性对照用PBS 代替一抗。PBS 洗3次，每次2min。（4）滴加抗兔生物素化二抗，37.0℃湿盒孵育10min。PBS 洗3 次，每次2min。（5）每片滴加HRP 标记链亲和素，37.0℃湿盒孵育10min。（6）制备并滴加DAB 显色液2min，自来水充分冲洗后，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片，镜检。光镜下观察结果，每张切片选取5 个视野，阳性显示为棕黄色或棕褐色。图像分析：随机选取5 个高倍视野（×200），计算每个视野的阳性面积比，取其平均值。阳性面积=每个视野阳性目标面积/整个统计面积×100%。

2.5 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠一般情况 正常组小鼠皮毛光润洁白，毛发浓密均匀柔软，精力充沛。模型组、润燥活血汤组、HCQ 组小鼠均存在不同程度、不同部位脱毛现象，精神及活动状态不及正常组。

3.2 各组小鼠唾液量比较 与正常组比较，模型组、润燥活血汤组和HCQ 组小鼠治疗前唾液量减少（P均＜0.05）。治疗第30 天，与模型组比较，润燥活血汤组、HCQ 组小鼠唾液量明显增加（P 均＜0.05）；润燥活血汤组和HCQ 组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与本组治疗前比较，治疗后润燥活血汤组、HCQ组小鼠唾液量均增加（P 均＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠治疗前后唾液量比较（mg，）

表1 各组小鼠治疗前后唾液量比较（mg，）

注：正常组为正常小鼠，常规饲养，无特殊处理；模型组为干燥综合征小鼠，予1mL 生理盐水灌胃；润燥活血汤组予润燥活血汤11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 组予硫酸羟氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；与正常组同期比较，aP＜0.05；与模型组同期比较，bP＜0.05；与本组治疗前比较，cP＜0.05

3.3 各组小鼠血清M3R 水平比较 与正常组比较，模型组小鼠血清M3R 表达量增加（P＜0.05）；与模型组比较，润燥活血汤组、HCQ 组M3R 表达量减少（P均＜0.05）。润燥活血汤组和HCQ 组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清M3R 表达水平比较（pg/mL，）

表2 各组小鼠血清M3R 表达水平比较（pg/mL，）

注：正常组为正常小鼠，常规饲养，无特殊处理；模型组为干燥综合征小鼠，予1mL 生理盐水灌胃；润燥活血汤组予润燥活血汤11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 组予硫酸羟氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；M3R 为毒蕈碱样乙酰胆碱3 型受体；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3.4 各组小鼠颌下腺M3R 表达量比较 与正常组比较，模型组颌下腺M3R 表达量增加（P＜0.01）；与模型组比较，润燥活血汤组、HCQ 组小鼠颌下腺M3R表达量减少（P 均＜0.05）。润燥活血汤组和HCQ 组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3，图1。

表3 各组小鼠颌下腺M3R 表达量比较（%，）

表3 各组小鼠颌下腺M3R 表达量比较（%，）

注：正常组为正常小鼠常规饲养，无特殊处理；模型组为干燥综合征小鼠，予1mL 生理盐水灌胃；润燥活血汤组予润燥活血汤11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 组予硫酸羟氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；M3R 为毒蕈碱样乙酰胆碱3 型受体；与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05

图1 各组小鼠颌下腺M3R 表达免疫组化图（SP ×400）

3.5 各组小鼠颌下腺病理形态学比较 正常组颌下腺呈现分叶状，腺泡结构正常，多表现为卵圆形，大小均一，无明显聚集，腺泡导管无扩张，导管和上皮未见变性、坏死，腺体间质无明显充血、水肿，未见明显淋巴细胞浸润等病理变化（见图2A）。模型组小鼠颌下腺腺泡上皮可见变性、增生，周围淋巴细胞浸润，部分成灶，导管管壁增厚，部分纤维化，但未见明显腺体萎缩（见图2B）。HCQ 组（见图2C）和润燥活血汤组（见图2D）颌下腺腺泡结构较模型组明显改善，间质充血水肿减轻，腺体萎缩得到抑制，浸润的淋巴细胞数量减少。与正常组比较，模型组小鼠颌下腺淋巴细胞浸润病理评分明显增高（P＜0.01）；与模型组比较，润燥活血汤组和HCQ 组小鼠颌下腺淋巴细胞浸润病理评分明显降低（P 均＜0.05）；润燥活血汤组和HCQ 组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

图2 各组小鼠颌下腺病理表现（HE ×400）

表4 各组小鼠颌下腺淋巴细胞浸润病理评分比较（分，）

表4 各组小鼠颌下腺淋巴细胞浸润病理评分比较（分，）

注：正常组为正常小鼠常规饲养，无特殊处理；模型组为干燥综合征小鼠，予1mL 生理盐水灌胃；润燥活血汤组予润燥活血汤11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 组予硫酸羟氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05

4 讨论

SS 发病机制与效应蛋白M3R 以及跨膜转运水分子蛋白AQP5 的异常表达密切相关。M3R 抗体主要分布于外分泌腺，是腺细胞分泌的重要分子基础[6-7]，可阻断乙酰胆碱能神经信号的有效传递。当腺体受到攻击，就会释放乙酰胆碱和神经肽等物质。结合并激活M3R，从而使颌下腺受损、血流反应减慢、唾液输出量减少，阻断腺泡内APQ5 的正常分布，造成涎腺分泌减少[2，8]，并可同时激活磷脂酶c 信号传导通路，增加腺体局部NO 水平，破坏涎腺组织结构，进一步减少唾液、泪液的分泌[9]。实验结果表明，敲除M3R 基因后，小鼠唾液流量明显减少，表明M3R 参与唾液分泌的过程[10]。同时，小鼠被M3R 结构肽段免疫后，动物模型出现类似SS 的临床表现[11]。秦源等[12]研究证实，通过调节AQP5 和M3R 通道，可改善腺体水分分布，维持人体正常的生理功能。因此，M3 受体是SS 的致病抗原，并且被抗M3R 抗体特定攻击。抗M3R 抗体与腺泡细胞上的M3 受体结合，发挥类似M3 受体阻滞剂的作用，促使炎症因子释放，损害腺体分泌功能，使腺体细胞凋亡[13]。

笔者通过临床实践总结出SS 的病机在于燥毒与瘀血。燥邪日久，使血脉干涩，停而成瘀，瘀血阻滞，致使气机失常，津液不能正常敷布，加重燥症。如此循环反复，渐成燥痹。刘丹等[14]认为，SS 病机总属气虚，阴亏和血瘀为本，燥热为标。因此，SS 的中医辨证并非单纯的阴液亏虚致使津液不足或者热邪炽盛灼伤津液所能概括，而是阴津亏虚的基础上，燥、毒、虚、瘀相互作用而致病。润燥活血汤是治疗燥痹的大法。根据临床经验总结出润燥活血汤为治疗主方。方中重用麦冬为君，生地为臣，君臣相辅，胃阴得养，津液得生；赤芍散邪行血，白芍既养阴生津，又解燥毒之邪，两药配伍敛阴凉血而不恋邪；桃仁为佐，活血祛瘀润燥，泄滞血，生新血，去血中之热；紫菀宣肺气，输津液，引诸药直达病所。诸药合用共奏养阴生津、润燥活血之功。本实验结果表明，润燥活血法能下调SS 小鼠M3R 表达，减轻淋巴细胞浸润，改善颌下腺腺分泌能力。[本文受浙江省中西医结合医院院内课题（No.hhyn201904）支持。]