乳腺宁贴片外敷对乳腺增生模型大鼠乳腺组织的影响

柯 靓，徐菁铭，史亚楠，王蓉芸，武 彪，徐小宏

(1.南昌大学第一附属医院普外科，南昌 330006； 2.浙江中医药大学a.第一临床学院，杭州 310053； b.护理学院，杭州 310053； c.附属第一医院乳腺科，杭州 310006)

estrogen receptor-α; progesterone receptor; Ki-67; animals,laboratory; SD rats

乳腺增生症(MGH)多见于育龄妇女，在乳腺疾病中约占70%以上，常表现为乳房疼痛和乳房肿块，异型乳腺增生与乳腺癌密切相关,近年来，呈现逐年上升趋势[1]。目前临床上尚缺乏有效的治疗手段，传统内分泌治疗或内服中药治疗虽然短期内可缓解乳房疼痛等症状，但疗效并不确切，而且长期服用易产生内分泌紊乱或肝肾毒性等严重副作用[2]。因此，如何长期有效地缓解乳房疼痛和抑制乳腺增生成为临床亟待解决的问题。本研究采用乳腺宁贴片外敷于乳腺增生模型SD大鼠的乳房，探讨乳腺宁贴片对乳腺增生症效应及其可能的作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

30只雌性SPF级SD大鼠，体重180～200 g,7～8周龄，性成熟，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司(SCXK(沪)2018-0006)。在浙江中医药大学动物实验中心进行实验，温度控制在20～25 ℃，湿度控制在50%～60%，光与暗环境间隔12 h循环。

1.1.2 试剂与仪器

乳腺宁贴片主要成分硫酸盐粉末及赋形剂成品(桂林市威诺敦医疗器械有限公司，批号：201906131)；苯甲酸雌二醇注射液(宁波第二激素厂，批号：181214)，黄体酮注射液(宁波第二激素厂，批号：190320)，增殖细胞核相关抗原Ki-67(美国Abcam 公司，批号：ab16667)，雌激素受体α抗体(ERα，美国Abcam公司,批号：ab32063)，孕激素受体抗体(PR，美国Abcam,批号：ab2765)；Nikon eclipse 80i显微镜(Nikon公司)，滨松数字病理切片扫描系统 NanoZoomer 2.0RS(日本滨松公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与给药

采用随机数字表法将30只雌性SPF级SD大鼠随机分为对照组(C组)、乳腺增生组(M组)和乳腺宁贴片组(T组)，每组10只。M组及T组参照文献[3]构建乳腺增生模型：对2组大鼠给予连续25 d 肌内注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1·d-1，序贯5 d肌内注射黄体酮针4 mg·kg-1·d-1。C组每日肌内注射NS 0.5 mL·kg-1·d-1，连续25 d。给药方法：从肌内注射开始,T组于大鼠第2对和第3对乳头外敷乳腺宁贴片中的膏药3 g，C组及M组于大鼠第2对和第3对乳头外敷等剂量赋形剂。3组大鼠每24 h换药1次，在每次外敷后都用缚带将大鼠的躯干部位缠绕，大鼠单笼喂养。

1.2.2 乳头直径、高度测量

干预第30天测量3组SD大鼠乳房的直径和高度，用电子游标卡尺测量SD大鼠第2对乳头的直径(即测量乳头的水平最大径)，高度(即测量从乳头尖到乳头基底的距离),并观察乳房的外观。

1.2.3 HE染色观察乳腺组织形态学表现

干预30 d后处死各组大鼠，取下大鼠左侧第2个乳头连同周围0.5 cm范围的皮肤，取材深度至肌肉层上方，浸泡至10%甲醛溶液中，通过固定、包埋、切片后，进行HE染色，在光镜下观察乳腺组织形态学变化。

判断乳腺增生的指标之一是乳腺的局部病理改变，可以进行半定量检测。腺泡的数量与导管腔的分泌物按分泌量分为4个级别[4]:“-”表示腔内没有分泌物；“+”表示乳腺导管腔内有分泌物，所占面积不足导管腔体积的1/4；“”表示乳腺导管腔内分泌物所占面积超过导管腔内体积的1/4且不足导管腔内体积的1/2 ；“”表示乳腺导管腔内分泌物所占面积超过导管腔内体积的1/2以上。根据增生程度可以将乳腺导管上皮增生分成4个级别 : “-”表示导管上皮无增生；“+”表示导管上皮的细胞层次为2层以上；“”表示导管上皮出现乳头状突起； “”表示导管上皮出现实性乳腺增生，导管腔内布满上皮细胞。

1.2.4 免疫组织化学检测乳腺组织ERα、PR和Ki-67蛋白表达

将SD大鼠的第2对乳头浸泡在10%的甲醛溶液中，固定至少24 h，并在蜡包埋后切成4 μm的切片。将切片放入60 ℃的烤箱中进行烘焙2 h，随后将切片脱蜡至水中，用蒸馏水洗涤2 min，然后进行高压热修复，用3%H2O2溶液封闭过氧化酶10 min，再经PBS洗5 min，如此重复3遍；向切片中分别添加一抗的抗雌激素受体a抗体(1：300)、孕激素受体抗体(1：200)和Ki-67抗体(1：100)，37 ℃孵育60 min，PBS洗涤5 min，重复3次；滴加二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗涤5 min，重复3次；DAB显色1～2 min，复染、透明后对切片进行封片，使用Nikon eclipse 80i显微镜进行观察并拍照，如若细胞浆内出现棕黄色的颗粒则表示为免疫组织化学阳性细胞表达，然后运用Image-Pro Plus 6.0软件测算3组照片的平均光密度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 乳头直径和高度

3组大鼠的乳头外形均无破损，M组的乳头竖起较坚实,乳头直径较C组显著增加(P<0.01)；T组乳头直径较M组显著减小(P<0.05)。M组乳头高度较C组显著增加(P<0.01)；T组乳头高度较M组显著减小(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠乳头直径和高度比较

2.2 乳腺组织形态学变化

C组大鼠的乳腺导管及管腔在光镜下没有明显扩张及分泌物，导管的上皮细胞呈排列规则；M组大鼠乳腺小叶的数量较C组呈明显增多趋势，乳腺的腺腔扩张同时出现大量分泌物，导管的上皮细胞呈排列紊乱且增生明显；T组大鼠的小叶数较M组呈减少趋势，大鼠的腺泡数呈减少趋势，乳腺的导管及管腔分泌呈减少趋势。见图1、表2。

A：C组；B：M组；C：T组。图1 3组大鼠乳腺组织HE染色(×200)

表2 3组大鼠乳腺组织病理学变化比较

2.3 乳腺组织ERα、PR和Ki-67的表达

M组ERα、PR和Ki-67表达水平较C组均显著增加(P<0.01)，T组ERα、PR和Ki-67表达水平较M组均显著减小(P<0.05)，见图2、表3。

图2 3组大鼠乳腺组织免疫组织化学表现

表3 3组大鼠乳腺组织ERα、PR和Ki-67表达水平比较

3 讨论

乳腺增生病多见于育龄女性，是乳腺疾病中的常见病，在中医学里是属于“乳癖”范畴，在乳腺组织形态中常表现为乳腺小叶腺泡数量呈增多趋势、导管上皮呈现过度增生、形态上发生变异、排列上发生紊乱以及复旧不全；与雌孕激素代谢紊乱、乳腺组织ERα和PR表达量增加或受体蛋白与性激素亲和力增加密切相关[2]。SAMOLI等[5]研究发现乳腺增生时体内雌二醇(E2)、雌酮和睾酮水平，尤其雌激素水平常高于乳房非增殖性疾病，这种激素水平升高的现象常常见于年龄在围绝经期或绝经后阶段的女性。E2绝对或相对增加能够在一定程度上促进乳腺上皮细胞增殖并增加Ki-67表达，与此同时，E2的增加抑制了乳腺细胞发生免疫反应，从而降低了乳腺组织的自我修复能力[6]。

本研究应用了肌内注射苯甲酸雌二醇25 d序贯肌内注射黄体酮5 d构建成大鼠乳腺增生病模型，M组大鼠的乳头高度及直径呈显著增加，在镜下可以看见乳腺小叶的腺泡数量增多，乳腺导管与腺泡上皮细胞的排列发生紊乱，腺管腔呈现显著扩张趋势，与此同时腺管内的分泌物呈增多趋势，这项研究中乳腺增生模型的病理特点与文献[3]报道相符。

有研究[7]发现，在非病理状态下(即正常时)乳腺组织中自由基的产生与清除是处于一个动态平衡的趋势，而过氧化氢酶(CAT)可以清除在炎症发生过程中的过氧化物自由基，从而达到强烈的抗炎作用，并可及时修复受损的乳腺细胞；在乳腺增生形成的过程中，腺体脂质过氧化水平和自由基活性通常呈现异常升高的趋势，而脂质过氧化作用的最终产物是丙二醛(MDA)，其具有细胞毒性的特性，从而能够导致乳腺细胞发生损伤，进而导致导管上皮与纤维结缔组织产生不同程度的增生，乳腺导管扩张和囊肿形成，甚至乳腺癌；在具有特异性催化特性的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的催化作用下，呈异常升高趋势的超氧阴离子自由基可以产生出H2O2和O2，H2O2再被过氧化氢酶还原形成H2O，从而导致乳腺间质水肿反复发作。乳腺组织间隙水肿时细胞外渗透压下降，促发乳腺上皮细胞低渗应激而激活细胞ERK1/2磷酸化，在乳腺增生的发生与发展过程中，ERK1/2通路是最重要的信号通路之一， ER同时也可调控Ras/Raf/ERK信号通路，从而调节细胞的增殖与分化，致使增强了血管内皮生长因子(VEGF)的表达，而VEGF的表达与乳腺增生的程度呈正相关，而VEGF能够导致内皮细胞的增生，增强其渗透性[8]。

PAN等[9]报道芒硝(是一种含水的硫酸钠矿物)外敷腹壁可预防老年性重症胰腺炎急性肠胃道损伤，其作用机理是由于硫酸盐粉末的晶体渗透压比人体组织的渗透压高，对于局部而言，外敷时组织形成一个高渗的环境，组织水可以通过渗透压的作用从而渗出，同时加速淋巴的循环，增强网状内皮细胞的吞噬能力，进而减少白细胞的浸润，从而促进炎症因子的吸收。乳腺宁贴片主要为硫酸盐矿石粉末加适量赋形剂制得硬膏，硫酸盐矿石粉末是一种多硫酸盐类，由硫酸根离子与多种金属元素阳离子相结合而成，主要成分包括Na2SO4、CaSO4、BaSO4、KAl(SO4)2。因此，本课题组进一步研究硫酸盐矿石粉末外敷乳腺增生模型大鼠，观察其疗效并分析可能机制。结果表明乳腺宁贴片外敷乳腺增生模型大鼠的乳头，可以达到降低其乳头直径和高度的效果，而且能够抑制乳腺的腺泡增长，抑制了导管上皮增生和分泌物产生，同时显著降低乳腺组织中ERa、PR 和Ki-67的表达。发挥效应可能为硫酸盐粉末外敷乳头增加了局部渗透压，通过皮肤渗透性作用，调节乳腺腺体间和上皮细胞的渗透压，加速局部乳腺间质间水肿的消退，减轻渗透应激，改变细胞的形态和血管脆性，减轻乳房疼痛和缓解乳腺增生。由于肿瘤放化疗常致严重的毒副作用，近年来通过渗透压等物理手段调节细胞增殖分化以及抑制肿瘤生长成为研究热点[10]。

本研究创新性通过硫酸盐矿石粉末外敷乳腺等物理手段有效缓解乳腺增生，避免长期服用他莫昔芬所致的内分泌紊乱，同时也避免静脉输注或经胃肠道用药，不仅用药安全而且价廉使用方便。