一种基于等P／V策略的生物反应器缩小模型的建立

赵丽丽，朱玉强，马动，张贵民，刘忠

山东新时代药业哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室，山东临沂273400

CD20人鼠嵌合单克隆抗体又称利妥昔单抗（商品名：美罗华），1997年在美国上市，是全球最畅销的单抗类药物之一，获批的适应症有：滤泡性非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞性非霍奇金淋巴瘤（diffuse large B-cell non Hodgkin′s lymphoma，DLBCL）等，目前国内利妥昔单抗仅有上海复宏汉霖生物制药有限公司产品（商品名：汉利康）于2019年2月25日获批上市。

近年来，质量源于设计（Qulity by Design，QbD）理念在抗体药物领域得到极大的推广和应用［1-2］。生产通常在大规模生物反应器中进行，如何稳定地进行大规模生产，需要企业在药品研发进入后期时，建立合适的规模缩小模型，并在此基础上进行实验设计（Design of Experiment，DOE）研究，分析细胞培养过程参数对关键质量属性（Critical Quality Attribute，CQA）的影响，确定过程参数的操作范围，以确保大型生物反应器具有稳定可靠的生产能力。

近年来，随着国内外抗体药物陆续上市，越来越多的研究关注规模缩小模型的建立，其中大部分缩小模型建立考虑等P／V策略［3-4］。同时，随着高通量技术和一次性材料的发展与应用，极小规模的生物反应器（250 mL）被应用于缩小模型建立，以减少研发成本及提高研发效率［5-6］。目前，国内针对规模缩小模型建立的文献报道较少，本文基于等P／V策略对规模缩小模型的建立进行相关研究。等P／V策略在缩小模型建立时，考虑生产规模反应器搅拌桨输入功率与反应工作体积的比值应与小规模生物反应器一致，相关公式为P／V=Npρn3D5／V。大型生物反应器与小型生物反应器相比，通常由于混合及传质效果变差而引起培养体系中的二氧化碳分压（pCO2）升高，较高的pCO2使细胞生长及抗体表达量降低［7-8］。因此，在建立规模缩小模型时，本研究应用降低空气通气量的方式，减少培养体系中CO2的溢出，以期保持与放大规模相近的pCO2。同时应尽量模拟大型生物反应器的空气及氧气同期控制策略，以期小型生物反应器能够较好地代表规模化生产。

规模缩小模型的建立过程中除了对细胞生长状况进行监测外，还需对细胞的代谢情况进行监测和分析，通常乳酸和铵离子是CHO细胞培养过程中非常重要的代谢副产物［9］。孙祥明等［10］研究发现，氨浓度的增加明显改变了细胞的代谢途径。因此，本文主要对规模缩小模型的乳酸和铵离子进行研究。代谢产物通常对CHO细胞的pH值等产生影响，从而影响CHO细胞的活力，进而影响细胞的生长及单克隆抗体表达量［11］。

本研究应用3 L生物反应器建立生产规模450 L生物反应器的缩小模型，采用亲和层析纯化抗CD20单克隆抗体，为进一步应用DOE法进行细胞培养过程表征研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞 稳定表达抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞由山东新时代药业有限公司构建。

1.2 主要试剂及仪器 T31基础培养基和补料培养基由山东新时代药业有限公司研发，均不含任何动物源成分；5 mL HiTrapTMrProtein A柱为美国GE公司产品；TSKgel G3000SW色谱柱为日本TSK公司产品；WCX-10弱阳离子色谱柱为美国Thermo公司产品；变性液PNGaseF为美国Prozyme公司产品；2AB-标记试剂盒为美国Sigma公司产品；XBrige Amide色谱柱和糖型分析抽提小柱为美国Waters公司产品；乳酸和铵离子检测试剂和生化分析仪为瑞士罗氏公司产品；血气分析仪RIPID-348为德国西门子公司产品；3 L和450 L生物反应器为德国赛多利斯公司产品。

1.3 C H O细胞培养制备抗体 采用3 L（7个批次）和450 L（3个批次）生物反应器流加-批式工艺进行细胞培养，相关培养参数见表1，其中3 L生物反应器初始空气通气量为50 ccm，氧气通气量与溶氧级联控制，与450 L罐溶氧控制方式一致，从培养第10天起空气通气量关闭，只通过纯氧控制溶氧。搅拌转速根据公式P／V=Npρn3D5／V计算得到，式中V代表工作体积，Np代表功率常数，n代表搅拌转速，ρ为培养液密度，D为搅拌桨直径。不同的搅拌桨类型Np不同，本研究基于等P／V策略进行缩小模型建立，研究用3 L生物反应器的Np为0.70，D为54 mm；450 L生物反应器的Np为1.30，D为325 mm。培养过程中每天取样监测细胞生长状况，并计算细胞活率（活细胞总数 ／细胞总数 ×100%）。应用血气分析仪检测离线pCO2含量，生化分析仪检测主要代谢副产物乳酸和铵离子含量。

表1 3 L和450 L生物反应器流加-批式工艺细胞培养参数控制Tab.1 Control of cell culture parameters of fed-batch process in 3 L and 450 L bioreactors

1.4抗体纯化 细胞培养16d收获，培养液经4528×g离心20 min后，经0.22μm滤器过滤，上HiTrapTMrProtein A亲和层析柱，分离纯化抗体，紫外分光光度法检测抗体表达量。

1.5 抗体质量检测 经5 mL HiTrapTMrProtein A柱亲和层析后的抗体应用TSKgel G3000SW色谱柱（7.8 mm×300 mm，5μm）检测抗体聚体，流动相为0.1 mol／L硫酸钠和1 mol／L磷酸氢二钠，流速1.0 mL／min，检测波长280 nm，检测时间20 min；应用WCX-10弱阳离子色谱柱（4 mm×250 mm）检测抗体酸性峰和碱性峰，流动相为50 mol／L磷酸二氢钾和1 mol／L氯化钠，流速1.0 mL／min，检测波长280 nm，检测时间30 min；应用XBrige Amide色谱柱（3.5μm，4.6 mm×150 mm）检测抗体糖型含量，流动相为100 mmol／L甲酸铵溶液和100%乙腈溶液，流速1.0 mL／min，检测波长激发光为330 nm，发射光为420 nm。

1.6 统计学分析 应用mini-tab软件对生产规模批次和规模缩小模型批次亲和层析后的抗体表达量、聚体含量、酸性峰含量、碱性峰含量及糖型结果（G0和G1F+G2F）进行双单侧检验（Two One-Sided Test，TOST）分析（α值设定0.05），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长状况及p CO2水平 应用3 L生物反应器建立的缩小模型与450 L生物反应器相比，细胞生长状况及活率基本一致，3 L和450 L生物反应器培养活细胞密度均在培养第14天达峰值，分别为27.8×106和27.3×106cells／mL，下罐密度分别为25.3×106和25.4×106cells／mL，下罐细胞活率分别为94.2%和92.6%，见图1。两种类型的生物反应器比较，3 L生物反应器培养10 d后应用单纯通氧气策略，细胞培养后期pCO2水平与450 L生物反应器中基本一致，见图2。

图1 3 L和450 L生物反应器细胞生长状况Fig.1 Cell growth in 3 L and 450 L bioreactors

图2 3 L和450 L生物反应器培养液中pCO2含量Fig.2 The pCO2 contents in culture medium of 3 L and 450 L bioreactors

2.2 细胞代谢情况 应用3 L生物反应器建立的缩小模型与450 L生物反应器相比，乳酸及氨的代谢基本一致，3 L和450 L生物反应器中平均乳酸含量培养前期增长较快，均在培养第5天达峰值，分别为1 636和1 557 mg／L，然后逐渐下降，下罐时乳酸含量分别为155和148 mg／L，见图3。3 L和450 L生物反应器中铵离子含量培养前期增加较快，培养第10～13天达平台期，然后继续增加，培养第16天下罐时达峰值，见图4。

图3 3 L和450 L生物反应器培养液中乳酸含量Fig.3 Lactic acid contents in culture medium of 3 L and 450 L bioreactors

图4 3 L和450 L生物反应器培养液中铵离子含量Fig.4 Ammonium ion content in culture medium of 3 L and 450 L bioreactors

2.3 抗体表达量及质量 3 L缩小模型抗体表达量、聚体、酸性峰和碱性峰、糖型G0和G1F+G2F含量的均值与生产规模各结果均值的差值均在生产规模3倍标准差范围内，见表2和表3。mini-tab软件分析显示，抗体表达量及各质量参数变量P值均＜0.05，见表4，证明均拒绝原假设，原假设抗体表达量及各质量参数变量在等价区间外，拒绝原假设即表达量及各质量参数变量均在等价区间内。因此可认为，3 L生物反应器建立的缩小模型与生产规模等价。

表2 3 L和450 L生物反应器抗体表达量及各质量参数均值和标准差Tab.2 Expression levels as well as mean and standard deviation of quality parameters of antibody in 3 L and 450 L bioreactors

表3 3 L和450 L生物反应器抗体表达量及质量参数TOST差值分析Tab.3 Analysis of TOST difference of antibody expression and quality parameters in 3 L and 450 L bioreactors

表4 3 L和450 L生物反应器抗体表达量及质量参数TOST分析T和P值Tab.4 T and P values of TOST analysis of antibody expression and quality parameters in 3 L and 450 L bioreactors

3 讨论

随着上海复宏汉霖生物制药有限公司生产的CD20人鼠嵌合单克隆抗体（商品名：汉利康）于2019年2月上市，国内其他CD20人鼠嵌合单克隆抗体也将陆续进入临床Ⅲ期。除此之外，越来越多的生物制品陆续进入临床Ⅲ期，合适的规模缩小模型有助于稳定生产工艺的开发。因此，规模缩小模型的研究也越来越受到关注。

国内外药品监督管理部门要求合理的规模缩小模型必须考虑规模效应，并代表拟定的商业规模过程。缩小模型建立成功的关键过程参数包括活细胞密度、细胞密度峰值、产物表达量等，质量属性包含抗体聚体含量、电荷异构体及糖型等。为了证明小试规模和生产规模质量属性的等价性，TOST越来越多地用于确定缩小模型和大规模工艺性能的可比性［12］。将规模可比性定义为-θ

本研究证明，应用后期关闭空气通气策略，有助于提高pCO2水平，达到与生产规模相近的pCO2水平。使用基于等P／V原则标准建立的缩小模型，经评估细胞生长、pCO2水平及主要代谢副产物含量，与生产规模相比具有等价性，本研究中的细胞经等P／V原则计算的搅拌转速所产生的剪切力不会对细胞产生较大损伤，因此在缩小规模细胞密度与活率与生产罐表现基本一致，相似的细胞密度和活率才能保证在缩小规模的代谢水平与生产罐一致，从而保证培养结束时抗体产量和质量的等价性。本研究应用TOST法分析表达量、聚体含量、酸性峰和碱性峰含量及糖型，结果表明，酸性峰和G0含量的平均值存在差异，但通过TOST分析显示，酸性峰和G0变量P值均小于0.05，因此差异并不显著。经综合评价抗体表达量、聚体含量、酸性峰和碱性峰含量及糖型结果，3 L生物反应器建立的规模缩小模型能够代表450 L生产规模流程，模仿商业规模细胞培养过程，培养终产品的质量属性能够代表商业化规模的产品质量属性。

本研究中小规模生物反应器缩小模型的成功建立，为进一步应用DOE法进行细胞培养过程表征的研究奠定了基础。DOE研究能够应用较少的资源及实验组，加速工艺表征及药品上市进程，使患者能够更快地接受本公司研发的CD20人鼠嵌合单克隆抗体的生物治疗。