肠道病毒71型抗原检测板不同保存方法稳定性的比较

杨婷，李娅娴，李亚东，严皎，王永蓉，赵勇，文瑜，杜宋婷，刘正玲

中国医学科学院医学生物学研究所，云南昆明650503

目前，ELISA法已广泛应用于医疗、生产实践及科研中，针对抗原或抗体的检测方法具有高度特异性、灵敏度及高通量等特性。稳定性是体外诊断试剂必备的基本属性，是确保产品在使用过程中安全有效的重要指标［1-2］，相关研究是体外诊断试剂盒注册申报资料中重要内容之一，也是确定试剂盒保存条件、有效期的唯一依据［3］。

包被固相载体的抗原在环境中的稳定性是影响ELISA试剂盒质量的重要因素。DESHPANDE［4］研究证实，抗原结合在聚苯乙烯塑料表面10 d后，约90%的抗原位点发生变性。选择能够延缓固相抗原抗体变性的环境条件是延长检测板有效期、维持稳定性的便捷手段。ELISA试剂盒的生产和贮存过程中，通常采用干燥和低温环境来延长检测板的贮存期，目前多家企业开发出相应的ELISA检测体系进行肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）抗原定量检测［5-6］，其中检测板多为干燥密封保存于-20或-60℃以下的预包板，或现包现用检测板，鲜有采用缓冲液进行湿保存预包板的相关研究。因此，本研究采用干燥保存和湿保存两种方法保存EV71抗原含量检测板，于不同保存时间检测不同抗原含量的EV71样品，通过统计学分析，评价两种方法保存EV71抗原检测板的稳定性，以期为生产厂家及检定机构自制EV71抗原ELISA试剂盒提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标准品及样品 EV71抗原检测国家标准品（20100701）购自中国食品药品检定研究院；EV71收获液（样品1和2，含量分别为320和300 U／mL）、EV71原液（样品3和4，含量分别为7 050和710 U／mL）、EV71半成品（样品5，含量为250 U／mL）均由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

1.2 主要试剂及仪器 牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）购自北京索莱宝科技有限公司；Tween 20购自美国Amresco公司；显色液购自美国KPL公司；HRP标记的鼠抗兔IgG购自美国Thermo公司；甘油购自四川西陇科学有限公司；抗体保护剂购自德国Candor公司；碳酸盐缓冲液（pH 9.6）、PBS、酶稀释液、羊及兔抗EV71多克隆抗体由中国医学科学院医学生物学研究所质量检定室制备；96孔板购自美国Corning Costar公司。

1.3 EL I S A法检测体系的建立 用羊抗EV71多克隆抗体［加入抗体保护剂，用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）按1∶4 000稀释］包被96孔板，100μL／孔，4℃孵育过夜；用洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01 mol／L PBS）洗涤3次，加入封闭液（含1.5%BSA的0.01 mol／L PBS），200μL／孔，37℃封闭1.5 h；用洗涤液洗涤3次，加入标准品（80 U／mL起进行倍比稀释，共8个稀释度）或待检样品（样品1~5分别从1∶4、1∶6、1∶40、1∶10、1∶4起进行倍比稀释，共7个稀释度），100μL／孔，37℃孵育2 h；用洗涤液洗涤5次，加入兔抗EV71多克隆抗体（以30%甘油作为保护剂，用酶稀释液按1∶2 000稀释），100μL／孔，37℃孵育1 h；用洗涤液洗涤5次，加入HRP标记的鼠抗兔IgG（用酶稀释液按1∶5 000稀释），100μL／孔，37℃孵育0.5 h；用洗涤液洗涤5次，加入显色液，100μL／孔，37℃孵育10 min；加入50μL 2 mol／L的H2SO4；用酶标仪检测A450和A630值。

1.4 两种方法保存E V71抗原检测板稳定性的检测按1.3项方法用羊抗EV71多克隆抗体包被20块96孔板，封闭，洗涤，即为EV71抗原检测板。将10块板弃去洗涤液，置室温自然干燥后，真空密封包装，置-25℃保存（干燥保存）；另外10块板用洗涤液浸泡，封口膜封口后置4℃保存（湿保存）。分别于保存0、20、40、60、90、120、180 d时，两种方法各取1块EV71抗原检测板，按1.3项方法检测5份样品。

1.5 统计学分析 应用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，采用两因素重复测量数据方差分析的方法进行检测，两因素为保存方法和保存时间。保存方法有两水平（干燥保存和湿保存），无需进行Mauchly的球形度检验，直接通过主体内效应检验；保存时间及保存方法与保存时间交互作用有两水平以上，需进行球形度检验，若检验结果不对称，需通过Greenhouse-Geisser法进行校正。均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法保存E V71抗原检测板对标准品的检测干燥保存和湿保存不同时间的EV71抗原检测板检测标准品结果变化幅度较小，见表1和表2。保存180 d后，两种方法保存的抗原检测板灵敏度（大于cut off值最高稀释度对应的抗原含量）均在1.25~2.5 U／mL之间，无下降趋势。

表1 湿保存EV71抗原检测板检测标准品的结果（A450-A630）Tab.1 Detection result of standard by EV71 antigen detection plate in wet storage（A450-A630）

表2 干燥保存EV71抗原检测板检测标准品的结果（A450-A630）Tab.2 Detection result of standard by EV71 antigen detection plate in dry storage（A450-A630）

2.2 两种方法保存E V71抗原检测板的稳定性 干燥保存EV71抗原检测板检测5份样品7个时间点均值分别为315.0、299.4、7 795.3、827.6、261.4 U／mL，湿保存检测结果均值分别为354.3、347.1、6 766.6、749.7、277.3 U／mL。两种方法保存的EV71抗原检测板对每份样品各时间点的检测结果变化幅度较小，均在±2 SD范围内，CV为4.8%~11.5%，均<15%，见表3。表明EV71抗原检测板两种保存条件下均具有良好的稳定性。

表3 干燥保存和湿保存EV71抗原检测板检测样品的结果（U／mL）Tab.3 Detection results of samples by EV71 antigen detection plate in dry and wet storages（U／mL）

2.3 统计学分析结果 保存方法两水平差异无统计学意义（F=0.930，P=0.390），表明两种方法无明显差异。保存时间及交互作用球形度检验结果均不对称（P<0.01），见表4，通过Greenhouse-Geisser法进行校正后，保存时间差异无统计学意义（P=0.325），保存方法与保存时间无交互作用（P=0.303），见表5。表明两种方法保存180 d时，检测板仍可保持较好的活性。

表4 Mauchly的球形度检验Tab.4 Mauchly sphericity test

表5 主体内效应的检验Tab.5 Test for intra subject effect

3 讨论

ELISA商品化试剂盒的质量关键在于产品的稳定性和有效期，为使预包被的抗原或抗体在较长时间内保持活性，同时使包被的检测板便于保存或运输，常将预包被的酶标板真空干燥后密封保存。随着保存时间的延长，由于塑料袋的质量等问题，难以确保酶标板处于真空状态，使覆盖在抗体蛋白表面的稳定剂受到空气中水分的溶解或微生物的污染，6个月（180 d）后检测相同样品的吸光度值略微偏低［7］。

蛋白质构象发生变化的原因较多，如溶液的pH、盐分、糖分的浓度、微生物的作用、空气的氧化、加热等化学物理因素［8］，为使包被酶标板的抗体蛋白活性不变，常加入包被稳定剂以保护抗体分子的活性。有研究证实，海澡糖［9］和聚乙二醇［10］能有效提高预包被板的稳定性。本研究用羊抗EV71多克隆抗体包被酶标板，未加入包被稳定剂，保存180 d后稳定性较好，可能与加入抗体稳定剂有关。

ANASRI等［11］研究发现，固定化抗体在硫酸铵-Tris盐缓冲液中能够于6℃保存95 d；于室温、40℃保存53 d仍能保持良好活性；空气干燥保存会使抗体迅速失活。本研究将包被的检测板分别进行空气干燥后真空保存及湿保存，两种方法保存的EV71抗原检测板对每份样品各时间点的检测结果变化较小，均在±2 SD范围内，CV均<15%，表明两种方法保存的EV71抗原检测板均具有良好的稳定性。抗体的不稳定可导致检测试剂盒试剂不稳定［12］，PIKAL等［13］用抗体稳定剂中的多糖替代了抗体干燥过程中损失的水分，从而维持抗体的稳定性。CHANG等［14］研究证实，抗体固定后能够获得特定的稳定性，也有研究证实，低温可确保抗体的活性，抗体保存温度越低，活性越好［15］。本研究中两种检测板均能获得良好稳定性的原因可能是由于抗体中加入了抗体保护剂，其中成分对抗体具有一定保护作用，同时保湿、低温和抗体固定化也具有一定的作用。

ELISA抗原含量定量检测是疫苗工艺优化、质量一致性的重要保证［6］，本研究采用两种方法保存的EV71抗原检测板检测结果差异无统计学意义（P>0.05），干燥保存法便于运输；湿保存法介于预包板和现包板之间，可省去真空包装过程及反复包被过程。生产厂家和检定机构可结合质量检定中的需求进行选择。