MACC1、SPON2在胃癌组织中的表达及其临床意义

顾俊骏 方德宁 袁洁璐 李兴华

我国是胃癌高发国家，每年新发胃癌病例约占全球总数的40%，因胃癌死亡的人数也居全球前列［1］。胃癌早期没有典型的临床症状，确诊时多数已是中晚期，这也是致使胃癌高死亡率的原因，因此研究者们一直在探索胃癌早期诊断及预后判断的关键因素。结肠癌转移相关基因1（metastasis associated in colon cancer 1，MACC1）是2009年由STEIN等发现并命名的一个新基因，长度约82.7 kbp，位于人类染色体7p21.2，包含7个外显子和6个内含子，翻译后形成包含821个氨基酸的MACC1蛋白，其异常表达往往伴随相关信号通路的激活，已被证实在胃癌侵袭转移中发挥重要作用［2］。既往研究显示，MACC1在多种恶性肿瘤包括胃癌中呈高表达，可能作为预后预测的生物标志物［3⁃5］。脊椎蛋白2（spondin 2，SPON2）属于分泌型外基质蛋白mindin⁃F⁃spondin家族成员，可介导细胞与胞外基质间信号传递，在机体获得性免疫和先天性免疫中发挥重要作用［6］。近年研究发现SPON2蛋白在肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤中呈高表达，且与疾病发展及预后有关［7⁃8］。也有研究报道 SPON2 是MACC1的一个重要转录靶标，两者协同参与乳腺癌的发生发展［9］，但在胃癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测胃癌组织中MACC1、SPON2蛋白的表达水平，并分析其与胃癌患者临床病理参数的关系，探讨其在胃癌中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2013年1月至2015年1月于本院行胃癌根治术的106例胃癌组织，同时收集90例癌旁正常胃黏膜组织（距离癌变部位＞5 cm），所有患者均经组织病理学确诊，以及同期于本院内镜下摘取的胃息肉组织83例。纳入标准：⑴所有患者均为首次治疗，术前均未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗；⑵接受胃癌根治术；⑶临床病理资料完整。排除标准：⑴合并心、肝、肾等重要脏器疾病；⑵合并其他恶性肿瘤；⑶合并感染性疾病；⑷合并意识障碍、语言障碍等不能配合完成本研究者。本研究经本院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 免疫组化检测MACC1、SPON2蛋白的表达水平

石蜡组织标本经脱蜡、包埋处理，连续4 μm切片，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。一抗采用兔源MACC1、兔源SPON2多克隆抗体20513⁃1⁃AP试剂盒（购自美国R&B公司），4℃孵育过夜；二抗采用鼠抗兔多克隆抗体（购自美国Sigma公司）。二氨基联苯胺（DAB）染色，苏木素复染，脱水、透明、封片。阴性对照用磷酸盐缓冲液作为一抗。按染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，黄色或棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分比评分：阴性记0分，阳性细胞比例1%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，＞75%记4分。两者乘积＞2定义为阳性，≤2定义为阴性；同时乘积≥3为高表达，＜3为低表达。

1.3 研究结局及随访

所有胃癌患者术后以电话或门诊方式进行随访，随访时间自确诊之日起，截至2020年1月，中位随访26个月，失访8例。前3年每1～3个月随访1次，第4～5年每6个月随访1次，之后每年随访1次。以患者死亡为终点事件，观察胃癌患者在随访结束时的生存状况。总生存期（overall survival，OS）定义为患者入组至因任何原因死亡的时间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。分类资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验，多重比较采用SNK检验；Kaplan⁃Meier法计算生存率，组间生存曲线比较采用log⁃rank检验；Cox比例风险回归分析影响胃癌患者预后的因素。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测MACC1、SPON2蛋白的表达水平

MACC1、SPON2蛋白染色主要定位于细胞质或细胞核，见图1。MACC1蛋白、SPON2蛋白在胃癌组织、胃息肉组织及正常胃黏膜组织中的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；多重比较显示，MACC1蛋白、SPON2蛋白在胃癌组织中的阳性表达率均高于胃息肉组织及正常胃黏膜组织（均P＜0.05），见表1。胃癌组织中MACC1、SPON2蛋白共表达阳性58例，同时阴性表达11例，仅MACC1蛋白阳性表达21例，仅SPON2蛋白阳性表达14例，两者蛋白表达水平无相关性（χ2=0.928，P=0.336）。

图1 免疫组化检测MACC1、SPON2蛋白在胃癌组织、胃息肉组织和正常胃黏膜组织中的表达（×100）Fig.1 Expression of MACC1 and SPON2 proteins in gastric cancer tissue,gastric polyp tissues and normal gastric mucosa tissues detected by immunohistochemistry(×100)

表1 MACC1、SPON2蛋白阳性表达情况［n（%）］Tab.1 Positive expression of MACC1 and SPON2 proteins in tissues［n(%)］

2.2 MACC1、SPON2蛋白表达水平与胃癌患者临床病理参数的关系

MACC1、SPON2蛋白表达水平均与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小无关（均P＞0.05），与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润程度及淋巴结转移有关（均P＜0.05），见表2。

表2 MACC1、SPON2蛋白表达水平与胃癌患者临床病理参数的关系［n（%）］Tab.2 Relationship between expression of MACC1 and SPON2 proteins and clinical pathological parameters in patients with gastric cancer［n(%)］

2.3 MACC1、SPON2蛋白表达水平与胃癌患者OS的关系

截至终点随访时间死亡70例，失访8例。Kaplan⁃Meier生存分析结果显示，MACC1蛋白高表达组中位OS为23个月，低表达组中位OS为34个月，差异有统计学意义（log⁃rank χ2=9.324，P=0.002）；SPON2蛋白高表达组中位OS为25个月，低表达组中位OS为34个月，差异有统计学意义（log⁃rank χ2=4.694，P=0.030），见图2。

图2 MACC1、SPON2蛋白高表达组与低表达组胃癌患者的生存曲线Fig.2 Survival curves of gastric cancer patients in the group with high expression and low expression of MACC1 and SPON2 proteins

2.4 影响胃癌患者OS的危险因素分析

单因素分析结果显示，分化程度、TNM分期、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、MACC1蛋白表达水平、SPON2蛋白表达水平与胃癌患者OS有关（均P＜0.05）；多因素分析结果显示，MACC1蛋白高表达（HR=1.173，95%CI：1.133～2.590，P=0.011）及SPON2蛋白高表达（HR=2.108，95%CI：1.124～3.955，P=0.021）是影响胃癌患者预后的危险因素（均P＜0.05），见表3。

表3 影响胃癌患者OS的单因素和多因素Cox回归分析Tab.3 Univariable and multivariable Cox regression analysis of OS in patients with gastric cancer

3 讨论

侵袭、转移是造成胃癌患者死亡的重要原因，因此探索胃癌转移发生发展的分子机制对提高患者生存率尤为重要［10］。既往研究［11］显示MACC1基因在肿瘤细胞中发挥核心作用，可能通过促进肿瘤细胞增殖分化，诱发侵袭和转移。有研究［12］发现MACC1的反义长链非编码RNA（lncRNA）MACC1⁃as1在胃癌组织中呈高表达，且其高表达可以稳定MACC1 mRNA表达，并上调MACC1蛋白表达；进一步研究发现，MACC1⁃as1可能通过AMPK/Lin28通路上调MACC1，并增强糖酵解和抗氧化能力而调控细胞代谢，为胃癌诊断及治疗提供了潜在靶标。也有研究［13］报道，MACC1蛋白在胃癌组织中明显高表达，而抑制MACC1表达可降低胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，并诱导细胞凋亡。本研究结果也显示，MACC1蛋白在胃癌组织、胃息肉组织、癌旁正常胃黏膜组织中的阳性表达率依次降低，提示MACC1蛋白可能参与胃癌的发生发展进程。进一步分析发现，MACC1蛋白高表达与肿瘤低分化、TNM高分期、肿瘤浸润程度高、淋巴结转移等恶性特征相关，与较短的OS也有关，说明MACC1可能参与肿瘤组织分化、浸润等恶性进展过程，多因素分析也显示MACC1蛋白高表达是胃癌患者预后不良的危险因素。

SPON2是mindin⁃F⁃spondin家族成员之一，该家族共享3个高度保守的结构域，其中FS、FS2是该家族的特有序列，TSR结构域则存在于多种蛋白家族［14⁃15］。近年来研究发现，SPON2 在多种肿瘤中表达，但其作用机制尚无系统报道。LU等［16］在复发转移的胃癌患者血清中发现SPON2表达水平明显高于胃炎患者和健康人群，下调SPON2表达可显著抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，且将细胞周期阻滞于G1/S期，通过线粒体途径还能加速细胞凋亡，并通过阻断ERK1/2通路激活抑制上皮⁃间充质转化，提示SPON2可能是胃癌诊断的标志物和治疗靶点。也有研究［17］发现，沉默SPON2可以降低胃癌小鼠移植瘤细胞增殖活性，而过表达SPON2可致使肿瘤细胞增殖加快，活性升高；通过基因检测发现Notch信号通路激活可介导SPON2上调，并与侵袭性进展有关，提示SPON2可能是抑制胃癌进展的靶基因。本研究结果显示，SPON2蛋白在胃癌、胃息肉、癌旁正常胃黏膜组织中的阳性表达率依次降低，SPON2表达水平与胃癌患者的肿瘤分化程度、TNM分期、浸润程度及淋巴结转移及预后生存情况有关，提示SPON2可能参与胃癌侵袭、转移等病理过程。本研究还发现胃癌组织中MACC1、SPON2蛋白表达无相关性，与两者在乳腺癌中的关系并不一致［10］，推测MACC1、SPON2在不同肿瘤中可能发挥不同作用。

综上所述，MACC1、SPON2蛋白在胃癌组织中的阳性表达率明显高于胃息肉组织和癌旁正常胃黏膜组织，其表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润程度、淋巴结转移及预后不良有关，可作为胃癌发生发展及预后的潜在生物指标，但具体作用机制有待研究。