南瓜嫁接提高冬瓜枯萎病抗性的化感机制

袁飞 刘子凡 廖道龙 高瞻 曹鑫鑫

摘 要：以自接冬瓜（SGwg）、自接南瓜（SGp）及南瓜嫁接冬瓜（Gwg）為材料，采用苗期接种法对植株抗病性进行比较，并通过平板试验分析其根系分泌物对冬瓜枯萎病菌菌丝生长的化感效应，同时采用GC-MS分析鉴定根系分泌物的成分和相对含量，为通过南瓜嫁接防治冬瓜枯萎病及开发植物源新农药提供理论依据。结果表明：（1）SGwg易感冬瓜枯萎病，Gwg与SGp高抗冬瓜枯萎病，且大田试验中Gwg的单瓜质量和小区产量明显高于SGwg;（2）Gwg和SGp根系分泌物对冬瓜枯萎病菌具有化感抑制作用，而SGwg根系分泌物对其具有化感促进作用;Gwg与SGwg的化感效果存在显著差异，而Gwg与SGp的化感效果差异不显著;（3）随处理时间的延长，Gwg根系分泌物的化感抑制效果明显增强，SGp的化感抑制效果变化不明显，SGwg的化感促进效果呈现逐渐下降的趋势;（4）嫁接植株根系分泌物的组成比自接南瓜和自接冬瓜均要丰富，且相对含量也与自接南瓜和自接冬瓜存在显著差异。综上所述，南瓜嫁接提高冬瓜枯萎病抗性的化感机制是嫁接改变了根系分泌物组成且含有抑制冬瓜枯萎病病菌菌丝生长的成分。

关键词：冬瓜;嫁接;枯萎病病菌;根系分泌物;分离鉴定

中图分类号：S642.3+S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）05-026-04

Allelopathymechanism of grafting with pumpkin rootstock on improving resistance to Fusarium wilt in wax gourd

YUAN Fei1， LIU Zifan1， LIAO Daolong2， GAO Zhan1， CAO Xinxin1

（1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China; 2. Institute of Vegetables， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， Hainan， China）

Abstract： With self-grafted pumpkin（SGp）， self-grafted wax gourd（SGwg） and grafted wax gourd（Gwg）as materials， the growth of the Fusarium oxysporum of wax gourd were measured by using mycelial growth rate method， the disease resistance were identified by using the seedling inoculation method， and the chemical element of SGp， SGwg and Gwg root exudates were anlysized by GC-MS. The results showed that： （1）SGpand Gwg are highly resistant to Fusarium wilt， while SGwg is highly susceptible. Single fruit weight and the yield of Gwg were significantly higher than that of SGwg. （2）Root exudates（RE） of SGp and Gwg could inhibit the growth of the F. oxysporum， while the RE of SGwg could promote the growth. The allelopathy of Gwg has significantly difference with that of the SGwg， but it has not significantly difference with that of SGp. （3）With the extension of treatment time， the inhibition effect of RE from Gwg was significantly enhanced， but the inhibition effect of RE from SGp did not decline， and the promotion effect of RE from SGwg has a decline trend gradually. （4）RE in Gw have more divers chemical elements than that in SGpand SGwg， and there are remarkable differences of RE component among the SGp， SGwg and Gwg.In conclusion， the allelopathy mechanism of Gwg with highly resistant to Fusarium wilt was the variation of RE component in grafted plants which could inhibit the mycelial growth of F. oxysporum.

Key words： Grafted; Wax gourd; Fusarium oxysporum; Root exudate; Extraction and identification

冬瓜（Benincasa hispida （Thunb） Cogn.）是葫芦科冬瓜属一年生蔓性草本植物，是一种营养丰富的食疗保健蔬菜[1]。海南是我国重要的冬瓜生产和供应基地，2018年冬瓜种植面积高达7006 hm2[2]。随着冬季异常天气发生频率的加大，全国对海南冬季瓜的需求量会越来越大。在土地有限的现实背景下，瓜农常选择连作种植，导致冬瓜枯萎病发生越来越严重，发病率一般为50%～80%。

冬瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的维管束病害，尖孢镰刀菌可以产生厚垣孢子，长时间存在于土壤中并在其中越冬，抵抗各种不良环境，继而侵染植物。植物病害的发生与化感作用密切相关[3]。根系分泌物是化感物质的重要产生源[4]，直接影响着土壤中病菌孢子的积累速率[5]。嫁接可以直接影响作物根系的生长状况，生产中瓜农也常采用嫁接的方法来提高植株對枯萎病的抗性，但前提是有相应的高抗砧木材料。前人研究表明，南瓜对瓜类枯萎病具有免疫性[6]，但采用南瓜砧木嫁接冬瓜的抗病性变化及其化感机制仍不清楚。前人只在嫁接辣椒[7]、嫁接西瓜[8]、嫁接茄子[9-10]方面有所研究。为此，笔者采用海砧1号南瓜为砧木，以三水黑皮冬瓜为接穗，选用苗期接种法对植株抗病性进行比较，并通过平板试验分析植株根系分泌物对冬瓜枯萎病菌菌丝生长的化感效果，同时采用GC-MS分析鉴定其成分与相对含量，为通过嫁接防治冬瓜枯萎病及开发植物源新农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

冬瓜品种为三水黑皮冬瓜，砧木为海砧1号南瓜，均由海南省农业科学院蔬菜研究所提供。在海南省农业科学院蔬菜所育苗基地育苗，嫁接获得冬瓜/南瓜（用Gwg表示）、冬瓜/冬瓜（用SGwg表示）和南瓜/南瓜（用SGp表示）幼苗。

枯萎病菌种为冬瓜枯萎病病原菌尖镰孢菌尖镰孢冬瓜专化型（Fusarium oxysporum Schl. f. sp. benincasae）生理小种 1 号，由广西农业科学院蔬菜研究所提供。采用PDA培养基（新鲜马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，去离子水1000 mL）在28 ℃恒温培养。

1.2 方法

1.2.1 嫁接冬瓜抗病性比较试验 试验于2019年11月在海南省农业科学院永发基地进行。采用苗期人工接种法对SGwg、SGp和Gwg植株进行枯萎病抗性鉴定[11]。每份材料接种30株，15 d检查发病情况，计算病情指数，参考郭堂勋等[12]的病情等级分级标准进行分级。

1.2.2 嫁接冬瓜产量比较试验 试验设在海南省农业科学院永发基地。2019年12月10日将SGwg和Gwg幼苗移栽于大田中，行株距1.50 m×0.75 m;每小区种植30株，3次重复，完全随机排列。单蔓整枝，每株留1个瓜。于采收期测定Gwg与SGwg处理小区的所有冬瓜的质量，统计每小区冬瓜个数，计算出单瓜质量。

1.2.3 根系分泌物枯萎病病菌化感试验 （1）根系分泌物制备：2019年12月取生长基本一致、3叶1心期的SGwg、SGp和Gwg幼苗，清洗根系，用海绵包裹固定在泡沫板进行液体培养，参考王伟等[13]的营养液配方，营养液大量元素的配方为：54.27 g·L-1 NH4NO3、17.69 g·L-1 KH2PO4、40.25 g·L-1 K2SO4、42.29 g·L-1 CaCl2、45.10 g·L-1 MgSO4·7H2O。将培养15 d后的植株根系分泌物用旋转蒸发仪浓缩至20 mg·mL-1（每mL溶液中含20 mg 根系所产生的分泌物），4 ℃冰箱保存备用[4]。（2）菌丝生长平板试验：取SGwg、SGp和Gwg的根系分泌物及其土壤浸提液，经0.22 μm的无菌过滤器过滤后，加入到PDA平板中，每皿加入5 mL。再用打孔器取直径为6 mm菌饼使菌丝朝下接入到PDA平板中央，28 ℃培养，3次重复，以加无菌水的平板为对照（CK）。3 d后测量菌落直径，每天1次，直到菌丝快长满培养皿为止，按下式计算化感效果[14]：

化感效果/%=[处理菌落直径-对照菌落直径对照菌落直径-0.60]×100。

1.2.4 根系分泌物成分与相对含量检测 取部分根系分泌物用85%的H3PO4调节pH 至2左右。放于-20 ℃冰箱，将收集的根系分泌物液体完全冰冻后，使用冻干浓缩仪低温干燥至粉末状。将其送至江苏三黍生物科技有限公司进行GC-MS分析鉴定。

1.3 数据处理

采用Excel 2016和DPS 7.05软件进行数据统计分析，用邓肯氏新复极差法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 冬瓜枯萎病病情指数的差异

从表1可以发现，南瓜及其为砧木嫁接的冬瓜枯萎病病情指数分别为0.00%和5.00%，均表现为高抗，而自接冬瓜的枯萎病病情指数高达90.00%，显著高于其他处理，表现为高感。

2.2 单瓜质量及小区产量的差异

从表2可知，嫁接冬瓜的单瓜质量达19.38 kg，小区产量达416.40 kg，均显著高于自接冬瓜，加之嫁接冬瓜高抗冬瓜枯萎病，说明该砧木嫁接的冬瓜在生产中的表现较好。

2.3 根系分泌物对冬瓜枯萎病病菌的化感效果

从表3可知，在处理后3～6 d，自接冬瓜根系分泌物对冬瓜枯萎病的化感效果均表现为促进作用，而自接南瓜和嫁接冬瓜根系分泌物化感效果均表现为抑制作用;自接南瓜和嫁接冬瓜根系分泌物对枯萎病病菌抑制效果的差异不显著，而与自接冬瓜的化感效果差异达到显著水平。嫁接冬瓜根系分泌物化感效果随着处理时间的延长而不断增强，而自接冬瓜根系分泌物化感促进效果随处理时间的延长而降低。

2.4 根系分泌物的成分及含量分析

按照相似度大于90%的原则鉴定出3种植株根系分泌物中含有28种化合物，其相对含量见表4。从表4可知，根系分泌物的成分复杂，包括酯类、醇类、烷类、酮类、胺类等，其中酯类物质含量最高。

另外，从表4还可以发现，嫁接冬瓜根系分泌物的种类比自接南瓜要多，自接南瓜中不含的物质有2，3-丁二硫醇、（Z）-9-十八烯腈、甲基氨-聚乙二醇-丙酸叔丁酯、1，2-双（三甲基硅氧基）乙烷、1，3-二-正-丙基-1，1，3，3-四甲基二硅氮烷、4-（三甲基硅基）吗啉和2，3，4，6-四-O-（三甲基硅烷基）己糖吡喃糖苷。嫁接冬瓜和自接南瓜根系分泌物中均含有而自接冬瓜不含的物质有1-（3-甲基丁基）-2，3，4，6-四甲苯、3-吡啶醇、双（三甲基硫化硅）和N-乙基-1，1，1-三甲基-N-（三甲基硅烷基）硅烷胺，但其相对含量均小于1%。嫁接冬瓜和自接南瓜根系分泌物相对含量显著高于自接冬瓜的物质包括硬脂酸-2，3-二（三甲基硅氧）丙基酯、四甲基硅烷丙三醇、N-（叔丁基二甲基硅烷）-N-三氟乙酰胺、三甲基硅烷N，N-二甲基氨甲酸盐、三甲基硅烷基棕榈酸酯、丙胺，二甲基硅烷衍生物和1，1，1，3，3-五甲基-3-乙酰氧基二硅氧烷;均比自接冬瓜根系分泌物相对含量显著低的物质为三甲基甲硅烷醇三硅甲烷氧基乳酸酯，这些物质的相对含量均大于1%。

3 讨论与结论

本研究结果表明，自接冬瓜易感冬瓜枯萎病，嫁接冬瓜和自接南瓜高抗冬瓜枯萎病;单瓜质量和产量也明显高于自接冬瓜，表明选用海砧1号作为砧木用来嫁接冬瓜是可推广应用的。前人研究发现，抗病棉花的根系分泌物能够抑制枯萎病菌厚垣孢子的形成[15];用抗病黄瓜根系分泌物处理接种枯萎病菌后的植株，发病率比用感病品种根系分泌物处理的低17%[16]。对3类植株的根系分泌物成分与含量分析发现，三者之间存在着明显差异，故认为根系分泌物的不同是植株抗病性强弱不同的原因[17]。

本研究结果表明，南瓜嫁接冬瓜的根系分泌物和自接南瓜的根系分泌物对冬瓜枯萎病菌均具有化感抑制作用，且没有明显差异，这与前人将感病接穗嫁接到抗病砧木会降低嫁接植株的抗性的研究结果不一致[9]，嫁接不只是简单的换根，砧穗互作会影响砧木根系的发育[18]和接穗的光合特性[19]等，继而改变嫁接冬瓜根系分泌物的成分和含量。在本研究中发现，随处理时间的延长，嫁接冬瓜根系分泌物的化感抑制效果明显增强，这可能与叠加作用有关[20];自接冬瓜根系分泌物的化感促进效果逐渐下降可能与根系分泌物中存在可被分解或有挥发性的有效成分[21]，或病原菌对化感物质产生一定的抗性或耐性及菌丝细胞具有一定自身缓冲能力有关[22]。

南瓜嫁接提高冬瓜枯萎病抗性的机制是嫁接改变了根系分泌物组分，且含有相对较多的抑制冬瓜枯萎病病菌菌丝生长的成分。但对根系分泌物成分特性的影响及其化感效应如何，还有待于进一步研究。

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