一种特异性标记在甜瓜白粉病抗性育种中的应用

夏伟伟 邓竹根 张慧君 高晴 徐甜甜 代伟

摘 要：为了验证一种特异性标记在甜瓜白粉病抗性育种中的实际应用效果，用CTAB法提取19份甜瓜亲本材料种子总DNA，合成与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁标记的特异性引物，通过PCR扩增出特异性Pm-2F连锁基因，酶切验证及测序。结果表明，筛选的19份甜瓜亲本材料中有3个抗病株系，抗病株系杂合的F1代种子在田间表现为强抗性，其他材料杂合F1代均表现感病。试验室结果与田间表现一致，符合率达到100%，表明此特异性标记可以应用于甜瓜白粉病抗性育种。

关键词：甜瓜;白粉病;Pm-2F;抗性;育种

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）05-015-06

Application of a specific marker in screening resistance to powdery mildew in melon

XIA Weiwei1， DNEG Zhugen1， ZHANG Huijun2， GAO Qing1， XU Tiantian1， DAI Wei1

（1. Anhui Jianghuai Hortriculture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China; 2. Huaibei Normal University， Huaibei 235000， Anhui， China）

Abstract： In order to verify the practical application of a specific marker in the breeding of melon powdery mildew resistance. The total DNA was extracted from a 19-member population of melon parent seeds by CTAB method. The specific marker for tightly linked to the Pm-2F gene with powdery mildew resistance genes of melon was synthesized. The specific Pm-2F linkage gene was amplified by polymerase chain reaction （PCR）， and then validated by restriction enzymes digestion and sequencing. The results showed that three disease-resistant lines in 19 parental materials were determined， which their heterozygous F1 generation for resistant lines showed strong resistance in the field， but others were susceptible to powdery mildew. The laboratory results were consistent with that in the field with 100%， indicating that this specific marker can be applied to the breeding of melon powdery mildew resistance.

Key words： Melon; Powdery mildew; Pm-2F; Resistance; Breeding

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫蘆科甜瓜属一年生蔓性草本植物，在中国种植面积约53.3 万 hm2 [1]。甜瓜属于我国高端农业产品，能够增加种植者的收入。甜瓜在种植过程中病害严重，其中以白粉病为主。白粉病主要危害甜瓜叶片，产生白粉，严重阻碍植株光合作用，导致甜瓜的产量及品质严重下降，而且白粉病的危害在甜瓜生长周期中一直存在。培育抗白粉病的优质甜瓜品种对于育种工作者显得尤为重要，但是传统育种方式工作繁琐、周期长，而且白粉病生理小种分化速度快。因此，利用分子标记辅助选择（marker-assisted selection， MAS）技术可以加快培育抗白粉病品种的进程[2-3]。

白粉病是一种真菌病害，甜瓜上引起该病的病原菌主要是单囊壳白粉病（Podosphaera xanthii）和二孢白粉病（Golovinomyces cichoracearum），其中单囊壳白粉病（P. xanthii）占主导地位[4]。在我国甜瓜白粉病生理小种主要有2个，不同的地方生理小种不同[5-7]，但P. xanthii 2F是国内白粉病优势小种[8]，因此对甜瓜白粉病优势小种P. xanthii 2F抗病基因的筛选至关重要。目前对白粉病抗病基因Pm-2F的研究较多，Pm-2F是单显性基因[8]。

科技人员对于白粉病分子辅助育种研究很多，已经开发出众多抗病标记，但是这些抗病筛选标记与抗病基因连锁距离较远，筛选结果不理想[9-13]。而笔者在本文中所使用的特异性标记是根据国内白粉病优势小种P. xanthii 2F的抗病基因Pm-2F研究所得，与抗病基因连锁距离近，常用于国内白粉病抗病材料筛选，是一种普适标记[14]。

笔者用此特异性标记来筛选甜瓜白粉病抗病材料，进行辅助育种，加快了育种进度。在本研究中试验结果与田间表现一致，表明该特异性标记可以作为瓜菜辅助育种工具，为加速育种进程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选用试材为甜瓜19份亲本材料及9份杂合F1代，所有亲本材料和F1代均为种子。

1.2 试剂

Pfu Taq DNA聚合酶、质粒小样提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自TIANGEN公司，限制性内切酶 Dde I连接酶购自赛默飞公司，DNA Marker购自TRANS公司。

1.3 引物设计及合成

根据文献下载特异性序列合成引物：Pm-F：5'-GCCCAACCTTCAACTCGATA'，Pm-R：5'-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3'。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.4 PCR扩增

以CTAB法提取19份甜瓜亲本材料种子总DNA为模板，用引物Pm-F、Pm-R进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共32个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化。

1.5 测序与比对

纯化的PCR产物送上海英潍捷基生物公司测序。利用软件DNAStar和DNAMAN Version 5.22进行序列处理、分析。多序列比较采用DNAStar Clustal V方法进行序列比对。

1.6 酶切

扩增的片段用限制性内切酶Dde I在37 ℃恒温水浴锅中酶切15 min，酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳。所扩片段能被Dde I酶酶切即为抗病材料，反之，为感病材料。

1.7 甜瓜F1代種子田间验证

9份甜瓜F1代种子（由测试的19份甜瓜亲本材料杂交获得）种植于大棚中，在植株生长各个阶段观察发病情况，标记、记录和拍照。

1.8 室内分子鉴定

所有分子试验于2019年3月份在安徽省合肥市长丰县吴山镇桥冲村江淮园艺示范园分子试验室进行。

2 结果与分析

2.1 白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段的扩增

以19份甜瓜亲本材料种子总DNA为模板，用特异性引物Pm-F、Pm-R进行PCR扩增，经电泳可见一条约为466 bp的特异性条带（图1）。

2.2 白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段序列比对分析

对纯化后的白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段进行测序，序列长度为466 bp。将19份甜瓜亲本材料白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段相关序列与已发表文献白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁抗病序列进行核苷酸序列相似性比对，发现3个甜瓜亲本材料（欧蜜父母，欧蜜母本和11号母本）核苷酸序列与已知抗病相关序列相似性达到100%（图2）。表明这3个亲本材料具有抗性。

2.3 亲本材料白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段酶切验证

将纯化的白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段进行酶切，发现有3个亲本材料（欧蜜父本、欧蜜母本和11号母本）所扩片段能被Dde I酶酶切（图3），白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段能够被Dde I酶酶切，说明对白粉病有抗性。亲本材料酶切结果和序列比对结果一致，表明这3个亲本材料具有抗性。

2.4 杂合F1代白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段酶切验证

将杂合F1代纯化的白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段进行酶切，发现携带白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段的欧蜜亲本杂合F1代扩增的对应片段能被Dde I酶酶切（图5），而未携带白粉病抗病基因Pm-2F紧密连锁片段的金喜亲本杂合F1代扩增的对应片段不能被Dde I酶酶切（图6）。

2.5 欧蜜亲本杂合F1代和金喜亲本杂合F1代田间验证

对9份甜瓜杂合F1代进行田间观察，发现与测序和酶切得到的结果一致，欧蜜亲本杂合F1代田间表现为强抗性（图7），金喜亲本杂合F1代在田间表现为感病（图8）。

3 讨论与结论

确定白粉病优势小种对于抗病基因的筛选至关重要。前人的研究表明，我国甜瓜白粉病均由Podosphaera xanthii引起，而2 France为优势小种[5]。笔者选用的特异性标记是根据国内白粉病优势小种P. xanthii 2F的抗病基因Pm-2F研究所得。试验结果与张春秋的一致[14]。

根据目前文献资料，我国甜瓜白粉病生理小种至少有2种（1和2 France[5] ）。海南、江浙等地区引起甜瓜白粉病发生的是优势生理小种2 [6，15]。而部分地区优势生理小种则不详[16] 。白粉病生理小种分化快，同一地区不同时期致病小种不同[17-18]。笔者选用的特异性标记在甜瓜白粉病优势小种2地区的应用效果非常明显，对于其他生理小种利用此标记进行分子辅助育种存在一定的风险。因而下一步要寻找其他生理小种的抗病标记和长期监测试验地区的小种变化。同时，其他关于抗白粉病的基因已陆续发表，如Pm-1，Pm-2、 Pm-3、Pm-4、Pm-5、Pm-6、Pm-7、Pm-E、Pm-F、Pm-G、Pm-H、Pm-W、Pm-X、Pm-Y[19]，这些抗白粉病基因的研究拓宽了分子育种标记的选择途径，这也是笔者下一步研究的方向。

笔者在本研究中对选用的19份甜瓜亲本材料种子，分别用测序、酶切验证和大田种植3种方法一一对应验证，结果一致。欧蜜父本、母本的杂合F1代表现为抗白粉病，表明试验所使用的特异性标记可以应用于甜瓜抗白粉病材料的筛选。而11号母本因故未得到F1代种子，抗病性有待进一步研究。本研究结果为甜瓜抗白粉病新品种选育提供了一种辅助性方法，为加快育种步伐奠定了基础。

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