趋化因子受体表达与结直肠癌淋巴结转移的关系研究

吕杨波 邱丹 陈震宏

近年来，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率呈上升趋势[1]。2018年全球新发恶性肿瘤约1 810万例，其中CRC超过180万例，总发病率为9.2%[2]。淋巴结转移是CRC最常见的侵袭方式，是影响预后的重要因素[3]。数据显示，无淋巴结转移的患者（Ⅰ～Ⅱ期）术后5年生存率达80%以上，而伴发淋巴结转移的患者（Ⅲ期）术后5年生存率仅55%左右[3-5]。然而，CRC淋巴结转移的分子机制尚未阐明，且缺乏针对性药物。淋巴结转移是指侵袭性强的癌细胞从原发灶脱离并入侵周围基质，穿过淋巴管壁，回流至区域淋巴结的边缘窦，形成淋巴结转移灶的过程[6-7]。淋巴结转移及淋巴细胞浸润相关分子标志物如趋化因子受体（chemokine receptor，CCR）等在恶性肿瘤的淋巴结转移中起重要作用[8]。本研究拟通过评估这些分子标志物在CRC组织中的表达，筛选出存在差异的标志物，比较其在正常淋巴结与转移性淋巴结中的表达，从而探讨CCR等分子标志物与CRC淋巴结转移的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1月至2019年12月在衢州市人民医院行根治手术的新发CRC患者100例为研究对象，所有患者术前经病理活检确诊。其中男62例，女38 例；年龄 34～81（59.3±11.6）岁；肿瘤直径 2.1～6.2（3.17±1.67）cm；淋巴结转移阳性37例，阴性63例；行右半结肠癌（包括盲肠、升结肠、横结肠）根治手术38例，左半结肠癌（降结肠、乙状结肠）根治手术29例，直肠癌根治手术33例。本研究经本院医学伦理委员会审查通过，所有患者或家属签署知情同意书。

1.2 CRC组织中相关分子标志物mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。术中留取CRC组织，按照Trizol试剂（美国Invitrogen公司）说明书提取总RNA。取1 μg RNA，使用Maxima First Strand cDNA Synthesis试剂盒（美国Fermentas公司）反转录为cDNA。采用NCBI primer blast设计引物，产物长度100～200 bp，退火温度57～60℃，引物序列见表1。在ABI 7500荧光定量PCR仪上，使用2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix试剂盒（美国 Fermentas公司）进行 RT-qPCR。采用 2-ΔΔCt法计算相关分子标志物mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.3 淋巴结中相关分子标志物蛋白表达检测 采用免疫荧光法。由病理科医生在手术切除组织标本中取所有肉眼可见或可触及淋巴结（主要包括肠旁淋巴结、中间组淋巴结、中央组淋巴结），3.7%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片，经病理确诊是否为转移性淋巴结后，采用Envision法进行多色免疫荧光标记，并在倒置荧光显微镜下观察并拍照，蓝色荧光为DAPI染色细胞核；红色荧光标记CCR2表达，绿色荧光标记CCR4表达。荧光强度分为6级：高倍镜下不见荧光为（-）；高倍镜下隐约可见荧光为（+/-）；高倍镜下可见荧光，低倍镜下隐约可见为（+）；低倍镜下可见荧光，高倍镜下清晰可见为（++）；高倍镜下荧光耀眼，低倍镜下清晰可见为（+++）；低倍镜下荧光耀眼，高倍镜下刺眼为（++++）。（-）为无表达，（+/-）、（+）为低表达，（++）及以上为高表达。所用抗体全部购自英国Abcam公司。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴结转移阳性与阴性患者CRC组织中相关分子标志物mRNA相对表达量比较 淋巴结转移阳性患者CRC组织中CCR2、CCR4 mRNA相对表达量均明显高于淋巴结转移阴性患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；淋巴结转移阳性与阴性患者CRC组织中CCR7、TGF-βR1、p53、CD3e、CD8a、IL-2RA mRNA 相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 淋巴结转移阳性与阴性患者CRC组织中相关分子标志物mRNA相对表达量比较（n=100）

2.2 CRC患者正常淋巴结与转移性淋巴结中CCR2、CCR4蛋白表达比较 正常淋巴结中CCR2呈低表达，甚至无表达，见图1a（插页）；但在转移性淋巴结中表达显著增强，见图1b（插页）。正常淋巴结中CCR4呈低表达，见图1c（插页）；但在转移性淋巴结中呈高表达，见图1d（插页）。

图1 CRC患者正常淋巴结与转移性淋巴结CCR2以及CCR4蛋白表达比较（CRC为结直肠癌；CCR为趋化因子受体；a、c：正常淋巴结；b、d：转移性淋巴结；×20）

3 讨论

肿瘤浸润淋巴细胞的出现是癌组织中发生肿瘤免疫应答事件的标志，也是许多癌症（如早期胃癌、黑色素瘤和直肠癌）中淋巴结转移的预测因子[9-10]。肿瘤浸润淋巴细胞增多，特别是T细胞增多，与肿瘤淋巴结转移的出现有关[9]。高频率CD8阳性淋巴细胞浸润的患者淋巴结转移明显减少[11]。因此，本研究对淋巴结转移及淋巴细胞浸润相关分子标志物表达与CRC淋巴结转移的关系作一探讨。

IL-2又称为T细胞生长因子，主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生，是所有T细胞亚群的生长因子。IL-2RA通常从细胞表面裂解，以可溶性受体（sIL-2R）的形式释放，该受体可以抑制IL-2的活性并起到免疫抑制的作用。目前有研究发现血清中IL-2RA水平与多种肿瘤的淋巴结转移密切相关[12]。但本研究结果显示，淋巴结转移阳性患者CRC组织中CCR7、TGF-βR1、p53、CD3e、CD8a、IL-2RA mRNA 相对表达量比较，差异均无统计学意义。

CCR是一类具有诱导白细胞定向迁移或侵袭的小分子蛋白，与肿瘤的炎性细胞浸润、转移和侵袭密切相关[13]。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）/CCL2是CC类趋化因子家族成员之一，主要结合CCR2并通过CCR2-CCL2轴趋化CCR2阳性的单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞[14]。研究表明，CCR2-CCL2轴与恶性肿瘤的血管生成以及肿瘤转移、预后等密切相关[15-16]。有研究发现，在口腔鳞状细胞癌中，CCR2-CCL2轴直接参与淋巴结转移[17-18]。CCR4是调节免疫稳态的重要CCR，被认为与血液系统恶性肿瘤进展有关[19]。研究表明，CCR4表达与肿瘤复发以及淋巴结转移、肺转移和骨转移等有关[20-21]。CCR4及其配体介导途径CCR4-CCL2轴被认为是除CCR2-CCL2轴外、与淋巴结转移相关的另一条重要途径[15，20]。本研究结果发现，淋巴结转移阳性患者CRC组织中CCR2、CCR4 mRNA相对表达量均明显高于淋巴结转移阴性患者；且CCR2、CCR4在转移性淋巴结中呈高表达。提示CCR2、CCR4可能是肿瘤细胞和免疫细胞入侵淋巴结的重要驱动因子，其确切分子机制仍需进一步研究明确。

综上所述，CCR2、CCR4表达与CRC淋巴结转移有关。