超高效液相色谱串联质谱法同时测定水产养殖池塘底泥中7种氟喹诺酮类药物

贾晨 高峰 孙娟 赵春晖 吕芳 张园 王秀林 沈媛

（北京市水产技术推广站/农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心（北京） 北京 100176）

1 前言

抗生素（Antibiotics）是一类由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属等）或高等动植物在代谢过程中产生的或由人工合成的化合物，它们是可以抑制或杀死其他微生物的一类次级代谢产物，能够干扰其它生活细胞的发育功能[1]。氟喹诺酮类药物作为其中一类抗生素，和其他抗菌药物作用不同的一点在于，其以细菌的脱氧核糖核酸为靶点，通过抑制细菌的DNA旋转酶的合成从而对染色体造成不可逆损害，导致细胞不再进行分裂，快速抑制细菌的生长，产生杀菌作用[2]。由于其抗菌谱广、抗菌活性强、与其他药物无交叉耐药性且价格低，因此被广泛应用于畜牧、水产养殖业中[3]。

氟喹诺酮类药物（FQs）是一类合成抗菌药物，低剂量的氟喹诺酮类药物在集约化禽畜和水产养殖中大量使用，具有促进禽畜生长和抑制水产品真菌感染等作用[4]。在其广泛应用的同时，也存在一些问题，一方面，过量使用会直接对人体造成危害，不良反应也有很多：会引起未成年动物关节组织中软骨损失；引起消化系统不良反应；造成血液系统中血细胞及血小板减少；肝脏毒化反应等[5]。另一方面，氟喹诺酮类药物通过不同途径进入环境中，其溶解性较差，且性质稳定、半衰期较长、不易降解，只能在紫外灯条件下进行光解或生物降解[6]，会在水环境和沉积物中不断进行累积，导致其在水环境和沉积物中的浓度不断升高，很容易引发细菌耐药性，甚至产生超级细菌，增加养殖患病风险，从而对人类身体健康产生潜在威胁。近年来，此类药物的不当使用所引起的环境污染和农产品质量安全问题也成为研究热点。

目前，此类药物的检测方法主要有：酶联免疫法[7]、高效液相色谱法[8-9]、胶体金免疫层析法[10]、液相色谱-质谱联用法[11-13]。液相色谱串联质谱法由于其较好的分离度和较高的灵敏度逐渐成为同时检测氟喹诺酮类药物的主要手段。因此，本文借助超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）高选择性、高灵敏度的优势，经过优化色谱条件、流动相种类和比例、EDTA缓冲液的pH值等措施，对复杂样品进行检测分析，能有效地节省检测时间和试剂耗材，适用于大批量样品的快速筛选和定量测定。

本文旨在建立一种测定水产养殖池塘底泥中氟喹诺酮类药物残留的检测方法，将其应用于实际渔场底泥检测，具有一定的实用价值，以期为水产养殖环境中抗生素的有效管理和控制提供理论依据和技术支撑。

2 试验部分

2.1 仪器与试剂

XEVO TQ-S液相色谱质谱联用仪（美国Waters公司）；ME204E电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Sorvall ST 16R台式高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Thermo CL31RMultispeed台式高速冷冻离心机（美国热电公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；MF10 basic研磨机（德国IKA公司）；KQ-300V型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、诺氟沙星（Norfloxacin，NOR）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、氟罗沙星（Fleroxacin，FLE）、氘代恩诺沙星（Enrofloxacin-D5，ENR-D5）、氘代环丙沙星（Ciprofloxacin-D8，CIP-D8）、氘代诺氟沙星（Norfloxacin-D5，NOR-D5）标准品：纯度均>98%，德国Dr Ehrenstorfer公司产品。上述标准品用甲醇配制成浓度为200μg/L的7种抗生素（ENR、CIP、NOR、LOM、PEF、OFL、FLE）混合标准溶液，再用甲醇配制成200μg/L的3种内标（ENR-D5、CIPD8、NOR-D5）混合标准溶液，将所配溶液于4℃避光冷藏保存。

甲醇、乙腈、甲酸：均为色谱纯，美国Fisher公司产品；十二水合磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠：国药化学试剂有限公司产品；无水硫酸镁：北京伊诺凯科技有限公司；超纯水：由Milli-Q型超纯水仪制备；磷酸盐缓冲液：称取34.6g十二水合磷酸氢二钠、6.45 g柠檬酸、18.6 g乙二胺四乙酸二钠，置于烧杯中，用1 mol/LNaOH溶液调节pH至4.0，用超纯水定容至500 mL，即为0.1 mol/L的Na2EDTAMcIlvaine缓冲溶液。

抽取的30个底泥样品均来自水产养殖场，采样深度1～2 m，每个底泥样品约500 g。底泥样品自然风干后，经研磨机研磨后，过100目筛（孔径为0.15 mm），每份样品约100 g。制样完成后防止样品受到污染或残留物含量发生变化，放置于密闭玻璃瓶中置于-18℃下冷冻保存。

2.2 样品前处理

准确称取1.00 g底泥样品（精确到0.01 g）置于50 mL离心管中，加入300μg/L内标物质，静置1 h，加入5 mL 0.1 mol/L的Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液，涡旋1 min，再加入20 mL乙腈，涡旋1 min后，25℃超声提取10 min，加入2.0 g无水MgSO4，涡旋1 min，以4 000 r/min离心5 min；移取上清液于100 mL的鸡心瓶中，40℃旋蒸至干。加入1 mL 20%甲醇溶液复溶，涡旋1 min，过0.22μm有机相滤膜于2 mL样品瓶中，UPLC-MS/MS测定。

2.3 实验条件

2.3.1色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，粒径1.7μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）+甲醇（B），梯度洗脱条件见表1；流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；进样量：5.0μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.3.2质谱条件

电离方式：ESI（+）；离子源：大气压电喷雾离子源；扫描方式：多反应监测扫描；离子源温度：550℃；脱溶剂气流量：1 000 L/h；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气体流速：150 L/hr；碰撞气体流速：0.18 mL/min，其他质谱采集参数见表2。

表2 7种氟喹诺酮类及3种内标物的UPLC-MS/MS质谱测定参数

在流动注射状态下，将7种FQs及3种内标的标准品分别配制成0.1mg/L的甲醇溶液，通过全扫描（Scan模式）确定［M+1］质子化离子峰（母离子）m/z。二级质谱分析（子离子扫描）得到各自碎片离子的信息，选取碎片离子峰值相对较高的2个碎片离子作为定量离子和定性离子。Intelistart自动优化各质谱参数。Q：定量离子，q：定性离子。

3 结果与讨论

3.1 色谱分析条件的确定

氟喹诺酮类药物具有两性基团，属于酸碱两性化合物，在水溶液中通常以离子形式存在，易与色谱柱内硅胶残留的硅醇基作用，从而造成色谱峰拖尾、峰形异常和保留值不稳定[3]。本文比较了不同品牌的色谱柱，最终选用ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）作为FQs的色谱分离柱，能够在8.0 min内完成色谱柱平衡和目标物的分离，分离度较好，峰型尖锐，避免了普通C18柱容易造成的峰形拖尾现象。

3.2 流动相种类和比例的选择

3.2.1流动相种类的选择

流动相的种类和比例不仅影响目标化合物的保留时间和峰形，还会影响到目标化合物的离子化效率，从而影响灵敏度。本实验分别考察了乙腈-水、甲醇-水作为流动相。结果表明，以甲醇-水作为流动相，质谱信号提高，峰形对称。又考察了在甲醇-水中添加不同量的甲酸对质谱灵敏度的影响，结果表明在水相中添加0.1%甲酸水溶液，有助于氟喹诺酮类药物的有效电离，使分子离子峰响应增强。最终选择采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

3.2.2流动相比例的选择

由于FQs之间存在着一定的差异，采用等度洗脱很难在短时间内达到基线分离，因此采用梯度洗脱方式分离。在实验中逐渐调整甲醇初始浓度，结果表明，初始甲醇比例越大，出峰越快，且对7种FQs的分离效果较差，峰型有重叠，而甲醇的初始比例较小时，出峰较慢，后出组分峰形变宽，灵敏度下降。综合考虑，确定梯度洗脱程序详见上表1。最终在最佳条件下得到7种FQs的多反应监测（MRM）色谱图（图1）。

图1 7种氟喹诺酮类药物的多反应监测（MRM）色谱图

3.3 样品提取时缓冲溶液的优化

由于氟喹诺酮类药物为酸碱两性化合物，在酸性和碱性条件下均可以提取[14]，那么选择最佳的条件可以更加有效地提取目标化合物。氟喹诺酮类药物容易与底泥中的金属离子结合，通过添加Na2EDTAMcIlvaine缓冲溶液，使EDTA与金属离子形成络合物，将底泥中的目标化合物游离出来，再添加有机溶剂进行提取。

本实验选取不同pH（2.0，4.0，9.0，11.0）的EDTA缓冲溶液进行对比试验，见图2。结果表明，pH=4.0时，7种FQs提取效果最为明显，且出峰良好；pH=2.0、11.0时，提取效果较差，pH=9.0时，虽然部分目标物也能提取，但是出峰不明显，且有杂峰出现干扰。所以本实验最终选择pH=4.0的Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液作为样品提取时的缓冲溶液。

图2 7种氟喹诺酮类化合物在不同pH Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液下的提取情况

3.4 标准曲线、线性范围和检出限

移取适量的7种FQs混合标准溶液，用空白底泥样品分别配制成不同质量浓度的基质标准溶液，目标物浓度分别为5.0、10、20、50、100、200μg/L。以各组分浓度与其色谱峰面积进行线性回归，结果均呈现良好的线性关系，相关系数均>0.995。以10倍信噪比（S/N）计算定量限LOQ，具体数值见表3。

表3线性方程、相关系数、检出限和定量限

3.5 方法精密度及加标回收率

称取底泥的空白样品1.0 g，对7种FQs进行低、中、高3个不同水平添加，不同组分每个浓度进行3个平行测定，结果见表4。从实验结果可知在加标量为10、50、100μg/kg的3个梯度下，7种FQs的平均回收率在83.1%～107.5%，相对标准偏差在0.9%～11.7%，结果表明该方法回收率及精密度可以满足药残检测的要求。

表4 7种氟喹诺酮类药物的加标回收率（n=6）

3.6 实际样品检测

采用本文建立的方法对30个渔场的池塘底泥样品进行检测分析，测得池塘底泥中主要是ENR残留，其检出率为90%，检出量为1.52～82.41μg/kg，平均含量为10.27μg/kg；其次是CIP、NOR、OFX，检出率分别为40%、37%、10%，平均检出量分别为6.4、3.40、2.02μg/kg；其他药物均未检出。

4 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱测定池塘底泥中7种氟喹诺酮类药物的残留方法并对色谱条件、流动相种类和比例、Na2EDTA缓冲溶液pH进行了优化，该方法简便快速，基体干扰小，线性范围宽，回收率和检出限均可满足分析检测要求，适用于水产养殖池塘底泥中氟喹诺酮类药物的残留监控。

该方法实用性强，适合应用于大批量样品的测定，可作为开展底泥药物残留快速筛查的一种有效手段，同时也能够为水产养殖环境中氟喹诺酮类药物的筛查提供数据支撑。