四川地区精液分析室间质量评价初探

吴应碧,郑 艳,余 林,贾烨菻,应丽娟,杨婷婷,徐金艳,李福平

四川大学华西第二医院生殖男科/出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，四川成都 610066

目前生育率下降已经成为一个大趋势[1-2]，全世界不孕不育发病率为8%～12%，由男性因素导致的不育占40%～50%[3-4]。精液分析为评估男性生育力最基本的检测项目，在男性不育的诊断、治疗和科研中具有极其重要的作用[5]。精液分析与其他检验项目比较，精液标本黏稠度高、非匀质性且其检测是在运动状态下进行，导致精液分析检测结果变异系数(CV)较其他检验项目大，实验室间的精液检测结果可比性差[6-9]。室间质量评价可增加精液分析实验室间结果的可比性，但目前国内精液分析室间质量评价整体开展较差，国家卫生健康委临床检验中心室间质量评价项目中无精液分析项目，部分地区如广东省[6]进行了精液分析室间质量评价的初步探索，但还未形成有效的方案，国内精液分析室间质量评价整体需要加强。目前四川地区精液分析整体现状发展滞后，实验室间结果可比性差[10]，缺乏室间质量评价。所以，本研究拟在四川地区开展精液分析的室间质量评价活动，探索建立四川地区精液分析室间质量评价体系，分析各实验室间精液分析结果的差异，为提高四川地区整体精液分析结果的准确性及可比性提供依据。

1 资料与方法

1.1参与室间质量评价单位 四川地区共17家实验室参与本次室间质量评价，涵盖四川地区6个市(成都市、绵阳市、攀枝花市、遂宁市、雅安市及达州市)，其中包括9家检验科、5家生殖中心及3家男科实验室。

1.2质控品标本来源 用于室间质量评价的精液标本在四川省人类精子库收集。在获得健康志愿者知情同意后收集其精液，志愿者在精液收集前进行乙型肝炎表面抗原、抗丙型肝炎抗体、抗梅毒螺旋体抗体、人类免疫缺陷病毒抗原/抗体检测，结果均为阴性。

1.3精子浓度质控品的制备 选取精子浓度在(10～100)×106/mL、30 min内液化、黏稠度正常、圆细胞浓度<1.0×106/mL的精液标本，将精液充分混合后，按每毫升精液中加入100 μL 10%(v/v)甲醛溶液充分混匀，分装于冷冻管中，密封管口，并在冷冻管外壁贴上质控品批号等标识，置于4 ℃冰箱储存。参照CNAS-GL05做均匀性评价，经ANOVA方差分析样品内及样品间无显著差异，样品是均匀的。

1.4精子活力质控品的制备 选取两份不同活力级别的精液标本，采用计算机辅助精子分析系统(CASA)分别录制数个15 s的视频，录制视频数(即采集视野数)以能评估到至少200个精子为限，计数前向运动精子比例。将两个标本的所有视频分别作为精子活力质控品1及活力质控品2。

1.5精子形态质控品的制备 选取10份浓度>15×106/mL的精液标本制作10张形态涂片，经改良巴氏染色后，1 000倍油镜下选取精子分布均匀的视野，采用高清摄像头采集图片，从上述10张涂片采集的图片中随机选取100个头部和尾部完整的精子并标记编号。

1.6质控品发放 将精子浓度、活力及形态质控品统一发放给参评单位，48 h内按照各自实验室日常精液分析检测方法分析质控品，并反馈分析结果。

2 结 果

2.1各参评实验室一般概况 四川地区共17家实验室参与本次室间质量评价，其中15家(88.24%)实验室反馈了检测结果，包括7家检验科、5家生殖中心及3家男科实验室。其中15家反馈精子浓度检测结果，14家反馈精子活力及精子形态检测结果。

2.2实验室检测方法比较 各实验室中浓度检测使用最多的方法为CASA检测，活力检测使用最多的方法为人工检测，形态检测全为人工检测，见表1。

表1 实验室检测方法及计数板类型结果比较[n/n(%)]

2.3实验室使用计数板类型比较 15家实验室中8家(53.33%)使用计数板类型为Makler计数板，各1家(6.67%)分别使用Macro计数板、精子计数池、红宝石计数板及牛鮑计数板，3家(20.00%)使用计数板类型不清楚。

2.4实验室精子浓度结果比较 15家实验室精子浓度质控品检测结果的CV值为29.84%，将浓度检测方法分为CASA方法及其他(人工和全自动)方法，CASA方法CV值(23.96%)低于其他方法CV值(43.16%)。将检测浓度使用计数板深度分为10 μm及非10 μm(3家100 μm、1家20 μm、1家15 μm)，10 μm的计数板浓度检测结果CV值(24.82%)明显低于非10 μm浓度检测结果CV值(42.66%)，见表2。

表2 15家实验室精子浓度结果比较

2.5实验室精子活力结果比较 14家实验室中，活力质控品1和2的前向运动精子比例的CV值分别为18.30%及12.97%，将活力检测方法分为人工方法及CASA方法，CASA方法检测前向运动精子的CV值明显低于人工方法，见表3。

表3 参评实验室前向运动精子结果比较

2.6实验室精子形态结果比较 14家实验室中，正常精子形态百分比的CV值较高，为72.13%。在对100个精子的形态评估中，仅有34.00%(34/100)的正常或异常精子所有实验室评估结果一致，68.00%(68/100)的精子评估结果不一致。异常形态精子中，过量残留胞浆的CV值最高(96.71%)，见表4。头部缺陷精子中空泡异常的CV值最高，为65.32%，颈部和中段缺陷中弯曲缺陷的CV值最高，为139.45%，主段缺陷中卷尾缺陷的CV值最高，为115.45%，见表5。

表4 参评实验室精子形态质控品评估结果比较

表5 参评实验室精子形态不同部位异常结果比较

3 讨 论

本次室间质量评价的质控品均在各参评实验室进行检测，且均由从事精液分析的技术人员按照日常分析方式进行检测，可反映该实验室实际精液分析水平。本次室间质量评价活动虽涵盖四川地区6个市，但仅15家实验室反馈了检测结果，因此该结果仅反映部分四川地区医疗单位精液分析室间质量评价水平。本研究为首次在四川地区开展精液分析的室间质量评价活动，虽参评实验室规模不大，但在此次组织开展室间质量评价活动中，累积了如何组织参评实验室、如何制订参评项目及如何制备与分发质控品等方面的经验，为后续大规模推动四川地区精液分析室间质量评价活动打下基础。

此次15家反馈了检测结果的单位中有7家(46.67%)在检验科进行精液分析，有文献提到，多数检验科精液分析是按照《全国临床检验规程》标准进行[11]，但《全国临床检验规程》中精液分析的项目、检测方法及参考值更新较慢，与世界卫生组织(WHO)推荐的精液分析标准有差异。目前全国推荐精液分析参考标准使用《WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen》第5版[12](以下简称WHO第5版)，因为该手册详细介绍了精液分析不同项目的具体操作、方法、仪器、参考值及质量控制措施等。

此次室间质量评价15家实验室精子浓度质控品检测结果的CV值较高(29.84%)。国内外文献报道的精子浓度检测结果CV值也较高，比利时[13]文献中CV值为19.2%，国内广东省[6]文献中CV值为34.09%，意大利[9]文献中的CV值分别为46.65%、59.03%和75.14%。分析精子浓度检测结果的CV值高于其他检验项目的原因可能为各实验室参考标准、使用方法及操作等不一致，如加样前混匀次数及混匀方式不一致。15家实验室中使用CASA方法检测精子浓度的CV值为23.96%，低于其他方法检测的CV值(43.16%)。对于精子浓度和活力分析，CASA结果较人工分析方法更客观准确，但不同的CASA分析仪器由于其分析原理不同、帧率不同、配备的精子计数池深度不同，结果会有很大差异[14-15]，仍需注意使用和评估各类型的CASA。不同计数板深度对精液分析结果也会产生影响，精子计数板深度与前向运动精子呈负相关，精子计数板深度与浓度结果呈正相关[16-17]。CASA计数精子时建议使用深度为10 μm的计数板，目的是确保精子既形成单层分布又能自由活动，从而保证视野内所有的精子都能被软件捕捉识别。

活力质控品1和2前向运动精子比例的CV值分别为18.30%和12.97%，均小于20%，较浓度及形态的CV值低，这一结果可能是由于活力质控品为视频，不需要各实验室分析前进行任何处理，从而降低了检测的误差和CV值。CASA检测前向运动精子比例的CV值明显低于人工方法，提示CASA较人工方法分析更客观，有更低的变异性。

本研究中，正常精子形态百分比的CV值为72.13%，国内广东省文献中精子形态的CV值为62.01%[6]，比利时[13]及意大利[9]文献中的CV值分别为79.4%及80%，精子形态的CV值远高于浓度及前向运动精子比例的CV值，分析原因可能主要为：(1)不同实验室参考标准不一致，在WHO的连续几个版本中，评估标准的变化及临界值的变化造成检测人员对精子形态理解不一致；(2)由于14家实验室全部采用人工方法进行形态分析，人为主观意识强，缺乏客观性，同一实验室不同人员对同一精子的认识均存在差异，对处于临界形态的精子，同一技术人员两次分析也可能存在不一致结果等。FILIMBERTI等[9]文献中对参评实验室进行形态教学课程后，形态CV值较教学前明显下降，证实了形态教学课程的重要性。

在异常精子形态中，头部缺陷较其他缺陷CV值低，过量残留胞浆CV最高，为96.71%。头部缺陷中空泡异常的CV值最高(65.32%)，颈部和中段缺陷中颈部弯曲缺陷CV值最高(139.45%)，主段缺陷中卷尾缺陷CV值最高(115.45%)，考虑原因首先可能为多数实验室更关注头部缺陷，尤其注重头部缺陷中精子外形及顶体大小的缺陷，而对其他缺陷类型(如空泡及弯曲等)关注及认识较少。其次，WHO第5版中对不同缺陷未给出具体定义，如卷尾的尾部需要卷曲到什么程度才能判断为卷尾，是否需要>360°才判断为卷尾；颈部弯曲未定义具体弯曲角度等，致使各实验室对精子形态有不同的理解及判断标准等。

综上所述，四川地区精液分析室间质量评价中，前向运动精子比例CV值最低，其次为浓度CV值，正常精子形态百分比CV值最高。为使四川地区不同实验室精液分析结果具有可比性，建议采取如下措施：首先建议各实验室采用WHO第5版作为实验室精液分析参考标准，参考该标准并结合实验室实际情况选择适合的方法和仪器设备，建立标准化操作程序，对于主观性强的精子形态分析可首先做好实验室内部人员比对，如采取共同阅片统一认识等方法。笔者希望通过本研究摸索建立精液分析的室间质量评价体系，推进各实验室精液分析技术的标准化操作及室内质量控制，提高四川地区各实验室检测水平，建立四川地区精液分析室间质评体系，最终达到实验室间精液分析结果互认。