衍生化串联质谱检测55种酰基肉碱方法的建立及其临床应用*

丁 丽，樊 新，张 瑞

空军军医大学第一附属医院检验科，陕西西安 710032

有机酸代谢病和脂肪酸氧化代谢病均属于常染色体隐性遗传病，是常见的遗传代谢病，在新生儿和成人中均可发病，临床表现无特异性，主要表现为肝病、心肌病及肌肉疾病等[1-3]。虽然许多种类的遗传代谢病目前已有相应的有效治疗方法，但是病死率和多种后遗症发生率的降低都依赖于早期的快速诊断和及时的干预治疗[4-6]。在过去，遗传代谢病的诊断和治疗大多数依赖于医生的临床经验和一些非特异性的生化指标检测。近年来，随着临床诊断学的不断发展，这种局面已经改观。其中，串联质谱分析技术在临床诊断，尤其是遗传代谢病筛查中的作用不容忽视[7-9]，自1989年MILLINGTON等[10]首次将串联质谱用于新生儿筛查以来，该项技术迅速发展，在遗传代谢病筛查中的作用越来越重要。但是目前常用的串联质谱法只能检测31种酰基肉碱[11-13]，扩大酰基肉碱的检测种类将为临床相关疾病的诊断提供更多可能性，本研究利用衍生化串联质谱法检测了55种酰基肉碱，考察了该检测方法的各种影响因素，并运用该方法对西部地区婴幼儿进行筛查诊断，以期为我国新生儿筛查项目的发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料来源 2014年5月至2016年1月采集来自西部地区自愿选择串联质谱筛查的婴幼儿标本2 869例，新生儿组入选标准为出生后3～28 d健康的新生儿，男999例,女927例；儿童组入选标准为28 d至1岁的健康婴幼儿，男490例，女453例。本项目已通过空军军医大学第一附属医院伦理委员会审批。

1.2标本收集与保存 儿童组：研究对象在上午7～9时采集空腹末梢血滴于专用采血滤纸上，形成几个均匀血斑，完全渗透，待自然晾干后，封于塑料袋内，-20 ℃冰箱保存待检。新生儿组：新生儿出生3 d后，哺乳多次，采足跟血于空白采血滤纸上，完全渗透，待自然晾干后，封于塑料袋内，-20 ℃冰箱保存待检。

1.3仪器与试剂 API3200型串联质谱仪购自美国AB生物应用系统公司，高效液相色谱仪采用美国安捷仑公司产品(Agilent 1200)，96孔板加热吹干装置购于杭州奥盛公司(MD200)。

甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等试剂购于美国Fisher公司，均为色谱级。将正丁醇和乙酰氯按体积比9∶1配制成3 mol/L的盐酸正丁醇溶液作为衍生化试剂备用，96孔聚丙烯板购于北京博奥生物集团有限公司。实验中所用氮气的纯度为99.9%以上。

酰基肉碱内标有8种：游离肉碱内标(d9-C0)、乙酰肉碱内标(d3-C2)、丙酰肉碱内标(d3-C3)、丁酰肉碱内标(d3-C4)、异戊酰肉碱内标(d9-C5)、辛酰肉碱内标(d3-C8)、十四酰肉碱内标(d9-C14)、十六酰肉碱内标(d3-C16)，上述同位素内标用甲醇稀释成萃取液，4 ℃冰箱保存，1个月内用完。

1.4检测指标 检测健康婴幼儿血中55种肉碱：游离肉碱(C0)、乙酰肉碱(C2)、丙酰肉碱(C3)、丁酰肉碱(C4)、异戊酰肉碱(C5)、己酰肉碱(C6)、庚酰肉碱(C7)、辛酰肉碱(C8)、壬酰肉碱(C9)、癸酰肉碱(C10)、十二酰肉碱(C12)、十四酰肉碱(C14)、十六酰肉碱(C16)、十七酰肉碱(C17)、十八酰肉碱(C18)、二十碳酰肉碱(C20)、二十二碳酰肉碱(C22)、二十四碳酰肉碱(C24)、二十五碳酰肉碱(C25)、二十六碳酰肉碱(C26)、甲基巴豆酰肉碱(C5:1)、辛烯酰肉碱(C8:1)、癸烯酰肉碱(C10:1)、癸二烯酰肉碱(C10:2)、癸三烯酰肉碱(C10:3)、十二烯酰肉碱(C12:1)、十四烯酰肉碱(C14:1)、十四碳二烯酰肉碱(C14:2)、十六烯酰肉碱(C16:1)、十八烯酰肉碱(C18:1)、十八碳二烯酰肉碱(C18:2)、二十碳烯酰肉碱(C20:1)、二十碳二烯酰肉碱(C20:2)、二十碳三烯酰肉碱(C20:3)、丙二酰肉碱(C3DC)、甲基丙二酰肉碱(C4DC)、戊二酰肉碱(C5DC)、己二酰肉碱(C6DC)、辛二酰肉碱(C8DC)、癸二酰肉碱(C10DC)、十二碳二酰肉碱(C12DC)、十四碳二酰肉碱(C14DC)、十六碳二酰肉碱(C16DC)、十八碳二酰肉碱(C18DC)、二十碳二酰肉碱(C20DC)、羟基丁酰肉碱(C4-OH)、羟基异戊酰肉碱(C5-OH)、羟基己酰肉碱(C6-OH)、羟基十二酰肉碱(C12-OH)、羟基十四酰肉碱(C14-OH)、羟基十六烯酰肉碱(C16:1-OH)、羟基十六酰肉碱(C16-OH)、羟基十八烯酰肉碱(C18:1-OH)、羟基十八酰肉碱(C18-OH)、羟基二十酰肉碱(C20-OH)水平，确定本实验室的参考值范围。

1.5方法

1.5.1样品处理方法 用打孔器在干血片上取直径3 mm的圆形血片(4个质控，一个空白)，置于96孔板中，每孔加入1.3中制备的萃取液100 μL，室温密封振荡15 min萃取血片中的22种氨基酸，转移萃取液至另一个96孔聚丙烯板，40 ℃加热氮气吹干，再加入60 μL 1.3中制备的衍生化试剂，eflon膜覆盖，置于65 ℃恒温箱内反应20 min，随后40 ℃氮气吹干，再加入80%乙腈100 μL溶解，铝膜覆盖，串联质谱仪检测。

1.5.2仪器设置状态 乙腈作为流动相，设置液相色谱的流速为300 μL/min，进样量为20 μL，每次测定酰基肉碱采用母离子扫描，子离子质荷比(m/z)为85 Da片段，扫描范围为m/z 210～502，一个样品测试需时间约2 min。

1.5.3资料分析 定量分析采用软件ChemoView 2.0.2版本(美国AB生物应用系统公司)，根据经过衍生化的同位素内标和各种酰基肉碱的离子峰强度，计算出所测标本中55种酰基肉碱的水平。

1.6影响因素的考察 分别考察抗凝剂使用、标本的保存时间、不同氮气吹干时间、内标液保存时间对测定结果的影响。

1.6.1抗凝剂使用对测定结果的影响 为了考察抗凝剂使用对测定结果的影响，将无抗凝剂的标本结果与含有乙二胺四乙酸(EDTA)及肝素标本的结果比较。直接采末梢血滴于干滤纸片上制备无抗凝剂的标本，采静脉血于含有EDTA的真空管混匀后滴于干滤纸片上制备含有EDTA的标本，采静脉血于含有肝素抗凝剂的真空管混匀后滴于干滤纸片上制备含有肝素抗凝剂的标本。

1.6.2标本的保存时间对测定结果的影响 通过比较将标本自然晾干后放置1 d的结果与自然晾干后放置7、14、21、28、35 d后进行检测的结果来考察过长的保存时间是否对本方法的测定结果有影响。

1.6.3不同氮气吹干时间对测定结果的影响 由于人体内酰基肉碱检测相对水平较低且性质不稳定，因此55种酰基肉碱是否可以完全衍生化，依赖于标本的前期处理。水的存在会直接影响衍生化，不同氮气吹干时间会影响标本中是否有水的存在从而影响衍生化过程，为此笔者考察了不同氮气吹干时间对实验结果的影响，比较了50 ℃，0.2 MPa氮气吹干条件下氮气吹干10、15、20 min对实验结果的影响。

1.6.4内标液保存时间与测定结果的影响 为了考察内标液的稳定性，笔者选择内标液于4 ℃保存1、7、14、21、28、42、56 d后进行检测，根据目标化合物的平均值和相对于第1天的偏差来比较保存时间对结果的影响。

1.7线性范围考察 采用本实验室建立的衍生化串联质谱法在上述优化条件下对2014年5月至2016年1月2 869例西部地区出生的3 d至1岁健康婴幼儿全血标本进行55种酰基肉碱检测，初步建立本实验室衍生化串联质谱法检测55种酰基肉碱的线性范围。

1.8方法精密度考察 根据批内变异系数及批间变异系数来考察本方法的精密度，同一标本，平行分为20组，一天内采用本方法同时进行标本前处理并检测，得到批内精密度。之后20 d内重复上述实验，得到批间精密度。

2 结 果

2.1抗凝剂使用对测定结果的影响 EDTA可使检测结果降低，肝素抗凝剂会使部分结果升高，故临床标本采集不宜使用抗凝血。使用新鲜末梢血制成的干血片可以用于酰基肉碱项目检测。因篇幅有限，仅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10检测结果，见表1。

表1 抗凝剂对肉碱检测结果的影响

2.2标本的保存时间对测定结果的影响 长链肉碱水平随着标本保存时间的延长而降低，建议标本在4 ℃保存14 d以内完成检测。因篇幅有限，仅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10检测结果，见表2。

表2 标本保存时间对肉碱检测结果的影响

续表2 标本保存时间对肉碱检测结果的影响

2.3不同氮气吹干时间对测定结果的影响 吹干10 min肉碱水平普遍偏低，吹干20 min肉碱个别指标偏移较大，吹干15 min肉碱指标均较理想。因篇幅有限，仅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10检测结果，见表3。

表3 不同氮气吹干时间对肉碱检测的影响

2.4内标液保存时间与测定结果的影响 同位素内标复溶后会逐渐分解或衰减，致使标准降低，检测结果增高，相比于第1天的测定结果，经过28 d左右个别指标变化就达到10%，建议同位素内标复溶后尽快使用，4 ℃冰箱保存效期为28 d左右。因篇幅有限，仅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10检测结果，见表4。

表4 内标液保存时间与肉碱检测结果的关系[μmol/L或μmol/L(%)]

2.5本方法精密度的考察 经过测量本方法55种酰基肉碱的批内变异系数为7.3%～9.9%，批间变异系数为11.3%～13.9%。

2.655种酰基肉碱的实验室参考范围 儿童全血9种酰基肉碱(C0、C2、C3、C4、C5、C6、C16、C18、C5DC)的参考区间随年龄的不同而异。与儿童组的各酰基肉碱参考区间比较发现，新生儿组C0低于儿童组；新生儿组C2、C3、C4、C5、C6、C16、C18、C5DC高于儿童组；新生儿组C8、C10、C14、C5-OH与儿童组相近。采用本实验室建立的串联质谱法检测健康婴幼儿全血中55种酰基肉碱的健康人群参考范围见表5。

表5 衍生化串联质谱法检测55种酰基肉碱的参考值范围(μmol/L)

3 讨 论

液相串联质谱技术主要是将被测物质分子电离成各种m/z不同的带电粒子，应用电磁学原理使粒子产生分离排列，通过测定离子峰的强度，获得确定化合物的相对分子质量、分子式[14-16]。该技术能在2～3 min内对一份标本进行几十种代谢产物分析，而通过对这些产物的分析，可以对30余种遗传性代谢病，包括有机酸代谢紊乱和脂肪酸代谢紊乱性疾病进行筛查和诊断[17-21]。

本研究结果表明，标本处理过程的最佳条件为：使用新鲜末梢血或肝素抗凝血制成的干血片于4 ℃保存标本，14 d以内完成检测，氮气吹干15 min，同位素内标复溶后尽快使用，4 ℃冰箱保存效期为28 d左右。本研究还根据优化的衍生化串联质谱法建立了本实验室的55种酰基肉碱的参考值范围。本实验室建立的衍生化串联质谱法具有快速、准确、特异的特点。此外，本研究还表明，儿童全血9种酰基肉碱的参考区间随年龄的不同而异。与儿童的各酰基肉碱参考区间比较发现，新生儿C0低于儿童；新生儿C2、C3、C4、C5、C6、C16、C18、C5DC高于儿童；新生儿C8、C10、C14、C5-OH与儿童相近。一方面可能是由于新生儿的肝、肾等重要脏器尚未发育成熟，在酰基肉碱的代谢方面可能明显不同于儿童；另一方面可能是由于新生儿的饮食主要为母乳或者奶粉，来源比较单一，而儿童的食物来源比较丰富，因此这两个群体之间酰基肉碱的摄入和利用存在明显不同，导致酰基肉碱的分布出现明显差异。

本文建立的衍生化质谱法可以测定更多的酰基肉碱，检测种类的增加为今后新生儿遗传代谢病的筛查乃至其他病种的临床研究和治疗提供了更多的可能性。儿科医生尤其是新生儿科医生应重视利用衍生化串联质谱技术进行遗传代谢病检测，以达到早诊断、早治疗的目的。