苜蓿中15 种农药残留的液相色谱-串联质谱确证方法研究

谷 旭，吴雨珊，高云峰，商方方，王 娇，梁海军*

（1.中国农业科学院饲料研究所，农业部动物产品质量安全饲料源性因子风险评估实验室，北京 100081；2.北京农检科技有限公司，北京 100193；3.黑龙江省农产品和兽药饲料技术鉴定站，黑龙江哈尔滨 150090）

苜蓿有“牧草之王”的称号，是目前世界种植面积最大、可利用价值最高、分布最广的牧草。苜蓿一年可收割4～7 次[1]，粗蛋白质含量可达18%，远高于小麦、玉米等其他牧草，在草食家畜养殖中有着不可替代的地位。国家实施振兴奶业苜蓿发展行动，带动优质苜蓿种植面积不断扩大，质量快速提升，有力促进了苜蓿产业的发展。苜蓿为多年生植物，营养价值高，为病、虫提供了一个相对稳定适宜的环境，为提高产量使用农药成为去除病虫草害不可避免的手段[2-7]。苜蓿生产中使用的化学农药有甲萘威、亚胺硫磷、异丙威等，使用最多的是有机磷类农药[8]。

残留在苜蓿中的农药经饲喂进入动物体，轻则影响畜禽生理健康和生产性能，严重可残留在畜禽产品中，对人体健康构成潜在隐患。虽然对农药残留检测方法研究报道很多[9-12]，但国内外对苜蓿中农药残留检测的研究较少[1]，对苜蓿中农药残留情况更是鲜有报道，因而有必要开展苜蓿等饲草中的农药多残留分析方法研究。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术具有高分离性能、高选择性、高灵敏度等优点，近年来国内[13-15]国外[16-17]许多农药残留检测均用LC-MS/MS 方法。利用LC-MS/MS 进行农药残留检测是分析领域的一个发展趋势[18-19]，QuErChERS 有着可应用的农药范围广、回收率、准确度、精确度高等优点[17,19]。本研究旨在建立一种有机溶剂提取、QuErChERS 技术净化和LC-MS/MS 技术联合检测苜蓿中15 种农药残留的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 甲萘威、仲丁灵、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威15 种农药标准品纯度均99%。试验所用试剂包括乙腈为色谱纯（美国Sigma Aldrich）、甲酸为色谱纯（美国Dikma Pure）、均质子（天津Agela Technologies）、MS-MG5052 QuEChERS 盐 包（50 mL，内含6 g 无水硫酸镁和1.5 g 无水乙酸钠）和MS-9PP0264购自天津Agela Technologies，QuEChERS 净化管（15 mL，内含1 200 mg 无水硫酸镁、400 mg PSA、60 mg PC、400 mg C18，MS-9PP0264）购自天津Agela Technologies、0.22 μm 尼龙针式过滤器。试验用水均为超纯水，风干苜蓿（2018 年5 月23 日播种，同年9 月28 日收割）来源于黑龙江省。

1.2 仪器与设备 APΙ 4000+液相色谱串联质谱仪（美国SCΙEX）：配电喷雾离子源（ESΙ）；离心机（日本Hitachi）；涡旋混匀器（美国Scilogex）；分析天平（德国Sartorius）

1.3 溶液配制 标准溶液配制：分别取15 种农药（敌草隆、仲丁灵、乐果、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威）标准品0.2 mg 于烧杯中，用乙腈溶解，溶解液全部转移至10 mL 的容量瓶中，烧杯用乙腈润洗3 次，润洗液全部转移至容量瓶中，用乙腈定容，配制成浓度为20 mg/L 的标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用。

混合标准液配制：上述15 种农药的标准储备液，分别准确移取1 mL 至25 mL 容量瓶中并定容至25 mL，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为0.8 mg/L 的混合标准储备液，于-20℃冰箱中储存备用。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取 称取2.00 g 经粉碎后的苜蓿样品于50 mL 离心管中（每个样品3 个平行），加入10 mL 水浸泡并平衡2 min，加入10 mL 乙腈和4 颗均质子涡旋混匀1 min，在样品中加入QuEChERS 萃取盐包（50 mL，内含6 g 无水硫酸镁和1.5 g 无水乙酸钠）剧烈振荡1 min，然后经8 000 r/min 离心10 min，分离提取液。

1.4.2 净化 将5 mL 提取液转移至15 mL QuEChERS 净化管，涡旋振荡1 min，8 000 r/min 离心5 min，取0.5 mL上清液和0.5 mL 水置于1.5 mL 离心管中，涡旋混匀后，过0.22 μm 滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证。

1.5 液相色谱-串联质谱条件

1.5.1 液相色谱条件色谱柱 Kinetex F5，2.6 µm，100 Å，3.0×50 mm；流动相：0.1% 甲酸的水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：30℃；液相色谱梯度洗脱程序：0～1.0 min，90%A-5%B；1.0～3.0 min，60%A-40%B；3.0～4.5 min，15%A-85%B；4.5～6.0 min，5%A-95%B；6.0～12.0 min，95%A-5%B。

1.5.2 质谱条件离子源 电喷雾电离子ESΙ（+），电喷雾电压：5.5 kV，喷雾器压力：50 Psi；气帘气压力：10 Psi；辅助气压力：55 Psi。离子源温度：500℃；采集模式：多反应监测模式（MRM）。

1.6 方法验证 在0.25～20 μg/L 内配制敌草隆、仲丁灵、马拉硫磷、乐果、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、三唑酮、烯唑醇、甲霜灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、多菌灵、二嗪磷、甲基异柳磷、异丙威15 种混合标准使用液，按本试验条件进行测定，拟合一次线性方程，标准溶液浓度（μg/L）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到15 种农药分别对应的一次线性回归方程。称取2.0 g 空白基质样品，采用基质加标的方法添加15 种农药，按照本试验的处理方法与条件进行检测，以3 倍基线噪声（S/Ν=3）计算方法检出限，以10 倍基线噪声（S/Ν=10）计算方法定量限。

采用基质加标方式，配制混合标准溶液，以2.5、5、20、50、100、200 μg/kg 共6 个梯度分别加入各标准药品，每梯度做 3 个重复，按照“1.4”进行前处理，按照“1.5”进行检测，并计算加标回收率及相对标准偏差（RSD）。

1.7 基质效应测定 由于苜蓿样品基质较为复杂，会对分析化合物的离子化程度产生很大影响，因此，本研究考察了苜蓿基质中分析化合物的基质效应，采用提取后添加法，添加水平为0.02 μg/mL，即基质加标。

参照“1.4”方法进行样品前处理，制得空白基质溶液稀释标样作为基质标样，该浓度的标准工作液作为溶剂标样。按“1.5”色谱条件和工作方法进行分析测定，记录各种农药的峰面积，按基质效应计算公式进行评价（如公式（1）所示）。若A/B＞1，则表示基质增强效应；若A/B＜1，则表示基质抑制效应；若A/B=1，则表示不存在基质效应。当A/B为0.8～1.2 时，基质干扰程度较低；当0.5 ＜A/B＜0.8 或 1.2 ＜A/B＜1.5 时，表现为中等程度的基质干扰效应；当A/B＜0.5 或A/B＞1.5，表示基质效应的干扰强烈。

式中，Mi为基质效应；A 为基质匹配标准品的峰面积；B 为纯标准品的峰面积。

2 结果与分析

2.1 质谱条件选择 将药物标准溶液以流动注射的方式进样，通过全扫描的方式确定其母离子。在对分子离子峰进行二级质谱扫描，得到碎片离子的二级质谱图。针对不同目标化合物以多反应监测（MRM）模式对其二级质谱的源内裂解电压、碰撞能量、离子驻留时间等参数进行优化，使每种化合物的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。选取丰度较高且较为稳定的2 对特征碎片离子作为定性离子。优化后的质谱条件见表1。

表1 15 种农药质谱参数

2.2 色谱条件选择 在苜蓿样品中分别加入15 种农药，通过“1.4”的方法进行前处理，再在“1.5”条件下进行检测，15 种农药的保留时间分别是敌草隆4.18 min、仲丁灵5.3 min、乐果3.6min、甲萘威4.1 min、亚胺硫磷4.5 min、氧化萎锈灵3.8 min、三唑酮4.5 min、烯唑醇4.6 min、甲霜灵4.1min、甲基硫菌灵3.9 min、嘧菌酯4.5 min、多菌灵3.0 min、二嗪磷4.7 min、甲基异柳磷4.9 min、异丙威4.2 min。选择离子流图如图1。

图1 苜蓿中15 种农药MRM 色谱图

2.3 线性范围、检出限与定量限 在0.25～20 μg/L 采用基质加标的方法添加15 种农药，以3 倍基线噪声（S/Ν=3）计算方法检出限，以10 倍基线噪声（S/Ν=10）计算方法定量限。由表2 可知，15 种农药在0.25～～20 μg/L 线性关系良好，相关系数（R2）为0.997～0.999 9，检出限（LOD）为0.01～0.5 μg/L，定量限为0.02～1.5 μg/L，符合多种农药残留分析要求。

2.4 回收率及精密度 由表3 可知，当加标量为2.5 µg/kg时，除敌草隆、甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、异丙威和甲硫威外，其他目标化合物的加标回收率为85.5%～118.5%；RDS 除敌草隆、仲丁灵、甲萘威、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、多菌灵外，其他目标化合物的相对标准偏差在3.4%～19.3%。当加标量为5 µg/kg时，除甲基硫菌灵和多菌灵外，其余目标物的回收率在76.7%～100.7%；精密度除敌草隆和多菌灵外，其他目标物的相对标准偏差在2.1%～18.6%。当加标量为20 µg/kg时，15 种农药的加标回收率在86.7%～117.3%；相对标准偏差为0.9%～18.5%。当加标量为50 µg/kg 时，15 种目标化合物的加标回收率为85.4%～107.6%；相对标准偏差在4.6%～14.0%。当加标量为100 µg/kg 时，15 种目标物的回收率在83.4%～110.4%；相对标准偏差 为2.4%～9.9%。当加标量为200 µg/kg 时，15 种目标物的回收率在83.6%～112.9%；相对标准偏差为1.3%～13.6%。本试验方法的回收率和相对标准偏差均满足农药残留分析方法要求。

表3 15 种农药的加标回收率结果和相对标准偏差（n=3）

2.5 方法的基质效应 由表4 可知，15 种农药中有14种的基质效应为30.9%～91.3%，表现为基质抑制效应；只有多菌灵的基质效应为126.0%，表现为基质增强。其中，仲丁灵、烯唑醇和甲霜灵受基质抑制干扰较低；敌草隆、乐果、三唑酮和嘧菌酯表现为中等程度的基质抑制效应，多菌灵为中等程度的基质增强效应；甲萘威、亚胺硫磷、氧化萎锈灵、甲基硫菌灵、二嗪磷、甲基异柳磷和异丙威均表现为强烈的基质抑制效应。

表4 15 种农药的基质效应 %

3 结论

综上，利用QuErChERS 前处理技术结合液相色谱-串联质谱法的分析方法进行苜蓿中15 种农药残留分析检测。该方法灵敏度高、简便、快速、准确、有机溶剂消耗量少。马建华等[13]对苜蓿进行五种农药的的残留分析，相关系数0.899 5～0.994 1。本研究中，15 种目标物在0.25～20 μg/L，线性良好，相关系数（R2）为0.997～0.999 9，检出限浓度在0.01～0.5 μg/L，定量限在0.02～1.5 μg/L，符合多种农药残留分析要求。张亚男等[20]利用气相色谱法测定韭菜中有机磷农药残留平均回收率在78.5～106.7%，在加标量为50 以上时，本方法的平均回收率为83.4～117.3%。回收率和相对标准偏差均满足农药多残留分析检测要求。另外，对苜蓿样品检测时的基质效应进行分析，检测的15 种农药中12种农药受基质效应影响较大，其中4 种农药表现为中等程度的基质抑制效应，1 种农药表现为中等程度的基质增强效应干扰，其余的7 种农药表现为强烈的基质抑制效应。本次试验利用基质空白匹配标准溶液进行定量分析，有效消除了基质效应带来的影响，满足苜蓿中农药残留分析的要求。因此，在苜蓿样品检测过程中需利用基质匹配混合标准工作液的方法来消除或补偿基质效应。本方法给我国苜蓿农药残留的风险评估、进出口检测等工作提供了一种准确的定量分析手段。