龙须菜生物脱腥工艺优化及其挥发性风味物质分析

杨 超，梁璋成，林晓姿，苏 昊，何志刚 ，郭京波 ，李维新

（1. 山西师范大学食品科学学院，山西 临汾 041000；2. 福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350003；3. 福建省农产品（食品）加工重点实验室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意义】龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）又名江蓠、凤菜等，属于红藻门、杉藻目、江篱属，是一种红藻类海洋植物[1]，在我国山东、浙江、福建、广东等地[2,3]的沿海海域大量栽培生产，成为继紫菜、海带、裙带菜之后的第四大养殖海藻。其富含海藻多糖、维生素、蛋白质以及磷、钙、碘、铁、锌、镁等多种矿物质以及多种人体必需的微量元素和活性物质，具有较高的保健和营养价值[4]。但因为龙须菜腥味大、适口性差，目前主要用于提取琼脂及作为鲍鱼等饲料开发，其深度开发利用受到制约，大量龙须菜资源未能得到充分的利用[5]。【前人研究进展】目前主要的脱腥方法有物理脱腥、化学脱腥、生物脱腥等[6]。其中，物理脱腥是通过采用香辛料、β-环糊精对腥味物质进行掩盖、包埋等，并没有从根本上去除掉这些腥味成分，脱腥效果差；化学脱腥利用一些化学试剂与腥味物质发生化学反应达到除腥的目的，但化学试剂的添加可能会对其他物质的结构造成破坏；生物脱腥利用食品微生物或酶技术对原料进行发酵脱腥，由菌种及其产生的酶类分解或代谢基质中的腥味物质，并形成特殊的风味物质[7]。因此生物脱腥不仅可实现海藻脱腥、改善风味，甚至有可能使活性物质增加或强化[8]。微生物发酵脱腥技术在鱼类、贝类脱除腥味成分方面[9－11]的应用取得了良好成效，但不同原料适宜的发酵微生物菌种及其工艺不尽相同。如马浩田等[12]用酵母菌发酵鲶鱼，在接种量1.0%，发酵温度35 ℃，发酵时间90 min条件下，脱腥效果最好；Seo等[13]采用米曲霉发酵海带，在转速120 r·min－1、30 ℃条件下发酵4 d的海带腥味物质成分下降，与发酵前相比，腥味强度下降了4倍。【本研究切入点】迄今鲜见生物脱腥在龙须菜中应用的报道。顶空固相微萃取-气相色谱质谱（HS-SPME-GC-MS）可定性、定量检测非气态物质里的挥发性气体成分，在检测挥发性风味物质方面应用广泛[14－16]，可用于检测龙须菜生物脱腥后风味物质的变化。【拟解决的关键问题】本试验以经济型海藻龙须菜为研究对象，通过感观模糊评判筛选出生物脱腥微生物菌种组合，优化发酵基料营养成分配比、菌种组合比例及接种量及发酵工艺参数，应用HS-SPME-GC/MS技术解析发酵前后龙须菜挥发性风味物质的变化，为龙须菜深加工、提 升其高附加值提供重要支持。

1 材料与方法

1.1 原料与主要试剂

原料：龙须菜（鲜品）由福建省宁德市三都镇基地采收，当天运回实验室于－20 ℃保存备用；白砂糖、苹果酸（食品级）、甘蔗糖蜜，市购。

菌种：植物乳杆菌（L.plantarum）R23、副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）RP38和 酿 酒 酵 母 （Saccharomyces cerevisia）JJ4，由福建省农产品（食品）加工重点实验 室分离、鉴定并保存。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；BC/BD-217CH冷柜，河南新飞电器有限公司；BS110S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；TGL16M台式高速冷冻离心机，上海诺顶仪器设备有限公司；LRH-160生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪，日本岛津科技有限公司；色谱柱为DB-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），SPME手动进样手柄及固定搭载装置50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，安捷伦科技有限公司；20 mL顶空进样 瓶，美国Supelco公司

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的制备 糖蜜培养基制备：将甘蔗糖蜜稀释至可溶性固形物至质量分数为5%，用柠檬酸调节pH至5.0±0.2，115 ℃高压灭菌30 min，用于酵母菌液体培养。

LH18培养基[17]：蛋白胨15 g·L－1，牛肉膏10 g·L－1，葡萄糖30 g·L－1，酵母膏7.4 g·L－1，柠檬酸铵2 g·L－1，硫酸镁0.36 g·L－1，硫酸锰0.05 g·L－1，吐温－80 1 g·L－1，番茄汁100 mL·L－1，苹果酸钠20 g·L－1，调整pH至4.8±0.2，121 ℃高压灭菌20 min，用于乳酸菌培养。

1.3.2 种子液制备 供试乳酸菌和酵母菌经活化后，分别接种于LH18培养基和糖蜜培养基中扩培至菌量达109cfu·mL－1和108cfu·mL－1，采用4 800 r·min－1、4 ℃离 心10 min，取菌坭加等体积无菌水振荡悬浮，待用。1.3.3 脱腥菌种筛选 龙须菜洗净沥干，长度切至大约3 mm，待用。取30 g龙须菜，按m（龙须菜）∶m（蒸馏水）=1∶2的比例置于150 mL的三角瓶中，添加2%（m/m）白砂糖、0.2%（m/m）苹果酸，水浴灭菌（100 ℃ 10 min）。冷却后按表1方案接种，每组处理重复3次，每组接种量各为5%（复合菌种按1∶1的比例接种），30 ℃发酵3 d。采用感官模糊综合评价对比分析确定适宜菌种。

表1 菌种接种方案Table 1 Bacteria inoculation program

1.3.4 脱腥工艺单因素试验 取30 g龙须菜，按m（龙须菜）∶m（蒸馏水）=1∶2的比例置于150 mL的三角瓶中，调整糖、酸后，100 ℃水浴灭菌10 min，冷却后接种发酵。各单因素设定为白砂糖添加量（m/m）为1%、2%、3%、4%、5%，苹果酸添加量（m/m）为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，接种量1%、3%、5%、7%、9%、发酵温度21、24、27、30、33 ℃、发酵时间1、2、3、4、5 d。固定处理参数为糖添加量2%，苹果酸添加量0.2%，菌接种量各5%，发酵温度30 ℃、发酵时间3 d。感官模糊综合评价法评价脱腥效果，每次试验处理重复3次，取 平均值。

1.3.5 Box-Behnken响应面试验设计 根据单因素试验结果，选择菌种添加量、发酵温度、发酵时间等3个因素作为自变量，以感官评价为响应值，对脱腥工艺进行响应面试验设计，因素与水平见表2。

表2 响应面试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experimental design

1.3.6 龙须菜挥发性风味物质分析 参照顾赛麒等[18－19]方法，略有修改。取龙须菜样品5 g置于20 mL的顶空进样瓶中进行萃取。萃取条件：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头老化温度250 ℃；老化时间15 min；平衡温度60 ℃；平衡时间30 min；250 ℃解吸附3 min，用于GC-MS分析。

GC条件：DB-5MS（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）；采用程序升温方式，起始温度50 ℃，保持3 min，以10 ℃·min－1的 速 率 上 升 至90 ℃，保 持5 min，以10 ℃·min－1的速率上升至230 ℃，保持2 min；以20 ℃·min－1的速率上升至280 ℃，保持5 min；载 气 为He，流 速1.0 mL·min－1；不 分 流 进样。MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描为m/z 35～550；发射电流100 μA。

气相色谱-质谱联用仪数据通过检索NIST2014谱库，选择RTE积分器进行积分，并通过选择质量数大于80的化合物，结合保留指数RI实现定性分析。扣除色谱图中的硅氧烷类杂峰及其他非嗅感物质杂峰，计算挥发性风味物质的总峰面积，采用面积归一化法计算各化合物的相对含量[20]。其中计算各挥发性组分的RI（保留指数），公式：RI=100n+100（txtn）/（tn+1－tn），其中tx、tn、tn+1分别为被分析组分和碳原子处于n和n+1之间的正构烷烃流出峰的保留 时间。

1.3.7 感官模糊综合评价

1.3.7.1 感官得分综合评判标准 组织13名接受过相关培训的食品专业师生组成评定小组。采用层次分析法建立龙须菜的评价域U={腥味U1，香味U2，滋味U3，色泽U4}，设定各评价指标的模糊权向量A={0.35，0.35，0.25，0.05}，设定评价等级S＝{优等S1，良好S2，合格S3，不合格S4}，品评标准见表3。选用M（－，+）算子建立模糊综合评价模型，各等级的轶值标准见表4，每个样品构成1个普通集合（论 域）：F={F1，F2，…，F19}，Fi{i＝1，2，…19}，Fi表示i种龙须菜样品，根据隶属度采用秩加权平均原则进行感官模糊综合评价[21]。

表3 龙须菜感官评分标准Table 3 Sensory scoring criteria of Asparagus

表4 各等级的轶值Table 4 Proliferation value of each grade

计算公式如下：13名评价人员对样品进行腥味、香味、滋味、色泽进行评价并归一化处理，各等级评价人数分别除以总评价人数，得到各指标的模糊权向量：U1={a1，b1，c1，d1}，U2={a2，b2，c2，d2}，U3={a3，b3，c3，d3}，U4={a4，b4，c4，d4}。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析，用 Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计及分析。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

由图1可知，不同菌种发酵产生的风味不同，组合发酵效果优于单一菌种发酵，以副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母JJ4按1∶1组合发酵的去腥效果最佳，且具有较愉悦的发酵香气和醇香，与其他处理的差异均达显著水平（P＜0.05），将该组 合处理作为后续试验的发酵菌。

图1 不同菌种发酵对脱腥效果的影响Fig. 1 Influence of fermentation of different strains on theeffect of deodorization

2.2 发酵条件对龙须菜脱腥效果的影响

由图2可知，当菌接种量为5%时，样品的感官得分值最高，继续增加接种量，其感官得分变化不显著（P＞0.05），考虑到节约成本，确定适宜接种量为5%；白砂糖添加量为2%时，样品感官得分最高，继续增加糖添加量样品感官得分不显著（P＞0.05），考虑到节约成本选择适宜的糖添加量为2.0%；苹果酸添加量过高过低，样品感官得分都较低，说明添加适量苹果酸有利于发酵风味的提高，最适苹果酸添加量为0.2%，与其他处理的差异均达显著水平（P＜0.05）；发酵温度对样品的感官得分的影响呈先上升后下降趋势，适宜的发酵温度为30 ℃，与其他处理的差异均达显著水平（P＜0.05）；发酵时间对样品的感官得分的影响呈先上升后下降趋势，发酵时间为3 d与1 、2 d处理的差异均达极显著水平（P＜0.01），与4 、5 d差异不显著（P＞0.05），因此选择适宜的发酵时间为3 d。

图2 发酵条件对脱腥效果的影响Fig. 2 Influence of fermentation conditions on the effect of deodorization

2.3 龙须菜生物脱腥工艺优化

2.3.1 响应面设计与建模分析 为进一步优化发酵条件，在单因素试验结果的基础上，以菌种添加量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）为自变量，模糊综合评价分值为响应值（Y），响应面试验结果见表5、6。响应值与各因素之间的二次多项回归方程为：

表5 响应面试验设计与结果Table 5 Design matrix and experiment results of responsesurface method

结果表明，二次回归模型差异极显著（P＜0.01），失拟项差异不显著（P＞0.05）,说明该模型适用于模拟响应值和各因素之间的关系，并且模型的相关系数R2=0.970 0，表明模型拟合度较好，可以采用该模型对龙须菜脱腥进行预判。3个因素对脱腥效果的影响程度大小为B＞C＞A，即发酵温度＞发酵时间＞菌接种量。寻优参数为：接种量5.1%，发酵时间68.3 h，发酵温度28.7 ℃，在此条件下响应值为7 2.7分。

2.3.2 响应面交互作用分析 两因素交互作用中，只有发酵温度（B）和发酵时间（C）的交互作用对感官评分影响显著，因此固定接种量在零水平，绘制出两因素交互作用响应面曲面分析图和等高线分析图（图3）。当发酵时间一定时，发酵温度低于29 ℃时响应值与发酵温度呈正相关，高于29 ℃时响应值则与发酵温度呈负相关；当发酵温度一定时，发酵时间短于68 h时响应值与发酵时间呈正相关，长于68 h时响应值与发酵温度呈负相关。在达到中心附

图3 发酵温度和发酵时间交互作用对感官评分的响应面和等高线Fig. 3 Tesponse surface and contour map of the interaction between fermentation temperature and fermentation time to sensory score

表6 二次回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance of quadratic regression model

2.3.3 最优发酵工艺的验证 为了验证模型的可靠性，在最优发酵脱腥条件下进行3次重复验证试验，所得到的响应值为（73.4±0.94）分，实测值与模拟预测值相对误差为0.96%，差异不显著（P＞0.05）。处理组的龙须菜无腥味，并具有愉悦的花果香等发酵 香且适口性强。

2.4 脱腥前后龙须菜中的挥发性风味成分变化

采用HS-SPME-GC/MS法对脱腥前后的龙须菜样品进行挥发性风味解析，共检出7大类54种成分，发酵前为36种，发酵后为37种，检测结果见表7，发酵前后龙须菜的挥发性物质种类和相对含量的差异如图4、5所示。烃类物质种类经过发酵由8种减为5种，总含量由17.45%降为5.96%，醇类物质种类经过发酵未变化，但总含量由6.91%升高为55.26%，脂肪味、腥臭味的环辛醇和1-甲基环庚醇发酵后消失，新检出具有芳香味的β-苯乙醇、（E）-2,4,4,7-四甲基-5.7 -辛二烯-3-醇。醛类种类经过发酵由7种减为4种，总含量从14.87%降为2.32%，其中具有鱼腥味的辛醛、脂肪味的正壬醛和（E）-2-壬烯醛发酵后未检出。酮类种类经过发酵由6种降为3种，总含量从42.55%降为5.8%，有泥土腥味中的3-辛酮含量明显降低，羟甲基呋喃酮、3-乙基-4-甲基-吡咯-2,5-二酮和2-十九烷酮发酵后未检出。酸类种类经过发酵由6种减为5种，总含量从6.52%增加到7.85%，其中4-甲基辛酸在发酵后未检出，癸酸相对含量增加。酯类种类经过发酵由5种增加为18种，总含量从4.88%上升到22.8%，新检出了具有水果香的己酸乙酯、酒香的辛酸乙酯、甜蜜香的乙酸苯乙酯、椰子香气的壬酸乙酯等13种物质，这些酯类物质可能

图4 龙须菜挥发性物质相对含量对比Fig. 4 Comparison of relative content of volatile substances in GL

表7 龙须菜挥发性风味物质HS-SPME-GC-MS分析结果Table 7 Analysis of volatile flavor components in GL by HS-SPME-GC-MS

对龙须菜良好风味贡献较大。总之，经发酵生物转化，具有脂肪味、腥臭味、鱼腥味的环辛醇、1-甲基环庚醇、辛醛、正壬醛、（E）-2-壬烯醛消失、具有泥土腥味中的3-辛酮含量明显降低，新增了具有芳香味的β-苯乙醇、水果香的己酸乙酯、酒香的辛酸乙酯、甜蜜香的乙酸苯乙酯、椰子香气的壬酸乙酯等，这些挥发性风味物质的减增对龙须菜的脱腥增香有重要贡献，这与杨少玲等[22]研究认为醛、酮等羰基类化合物是龙须菜腥味形成的主要物质的结果相一致。

续上表

续上表

图5 龙须菜挥发性物质种类对比Fig. 5 Comparison of volatile substances in GL

3 讨论与结论

龙须菜采用生物脱腥具有显著效果，其中以副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母JJ4的组合菌脱腥效果最佳。试验中采用组合菌对龙须菜进行脱腥的效果明显优于单一菌种，可能是由于组合菌发酵所利用的底物面宽和代谢产物更丰富，进而风味更好。如王丽红等[20]研究了用乳酸菌、酵母菌单菌及组合菌分别发酵海带后风味物质的变化，结果表明组合菌发酵产生的风味物质兼于各单菌种发酵产生的，并且复合菌发酵后风味协调。

影响龙须菜生物脱腥的因素有菌接种量、发酵时间、发酵温度，其影响大小顺序为发酵温度＞发酵时间＞菌接种量，经Box-Behnken响应面优化得到龙须菜最佳的脱腥参数为：白砂糖添加量2%、苹果酸添加量0.2%、接种量5%、发酵时间68 h及发酵温度29 ℃，该工艺条件发酵下感官评分为73.4。

龙须菜经副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母JJ4的组合菌生物发酵脱腥后，具有脂肪味、腥臭味、鱼腥味的环辛醇、1-甲基环庚醇、辛醛、正壬醛、（E）-2-壬烯醛消失，具有泥土腥味中的3-辛酮含量明显降低，新增了具有芳香味的β-苯乙醇、水果香的己酸乙酯、酒香的辛酸乙酯、甜蜜香的乙酸苯乙酯、椰子香气的壬酸乙酯等，这些挥发性风味物质的减增对龙须菜的脱腥增香有重要贡献。