小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫功能的影响

裴文刚，常秉乾，杨敏敏，王海波，秦士贞 ，史兆国 ，李志勇

（1. 甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2. 甘肃德福生物科技有限公司，甘肃 定西 744300）

0 引言

【研究意义】维持正常的免疫功能是肉鸡抵抗疾病和健康快速生长的基础，但在集约化养殖模式下，抗生素和其他抗病药物的大量使用导致肉鸡免疫水平普遍低下，抗病力下降，传染性疾病发病率上升，免疫抑制性疾病危害日益增大，给肉鸡养殖行业带来了巨大挑战[1]。小球藻是一种单细胞绿藻，在我国分布广泛，尤其以淡水水域较多，其不仅能利用光能自养，还能在异养条件下利用有机碳源进行生长繁殖，且易于人工培养[2]。小球藻含有丰富的蛋白质、多糖、必需氨基酸、脂肪酸、类胡萝卜素和矿物元素，具有全面而均衡的营养价值和生物保健功能[3]。小球藻生长因子（CGF）是小球藻独有的活性成分，具有提高动物生产性能、增强机体免疫力和抗病力等功能[4－5]。金藻液由有效微生物群（EM）和小球藻悬浮液混合发酵而成，通过微生物发酵可以使小球藻达到较好的破壁和脱腥效果，从而提高动物的吸收率和摄入量。【前人研究进展】诸多研究发现，小球藻及其活性成分CGF具有促进动物生长、增强免疫功能、解毒保肝、抗肿瘤和维持动物胃肠道内菌群的均衡等重要作用[6]。饲粮中添加小球藻能改善饲粮中蛋白质和维生素的代谢过程，提高肉鸡生产性能，增强免疫力，提高成活率[7]。益生菌发酵小球藻在提高蛋鸡的产蛋率、蛋品质、肝脏三酰甘油含量和盲肠菌群分布方面的作用效果显著高于普通小球藻[8]。近年来，诸多研究人员通过对肉鸡进行营养调控或在肉鸡饲粮中添加酶制剂、中草药和微生态制等添加剂的方式代替抗生素以提高肉鸡的免疫力和抗病力并取得了不错的效果[9]。本课题组以良凤肉鸡为试验动物，其每天定量饲喂小球藻悬浮液、金藻液和二者联用液。结果表明，三者均能不同程度改善肉鸡的生长性能和屠宰性能[10]。【本研究切入点】随着我国藻类生物技术的发展，将小球藻干粉作为饲料添加剂在提高动物生产性能和免疫功能方面的研究已有初步探索，但小球藻悬浮液和金藻液在肉鸡生产中的应用鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究从小球藻的免疫活性这一研究热点出发，旨在探究小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫功能的影响，以期为其在肉鸡生产中的合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小球藻悬浮液和金藻液由甘肃德福生物科技有限公司提供。小球藻悬浮液，pH值7.5～8.0，主要有效成分为小球藻活细胞，藻细胞含量＞2.0×107个·mL－1。金藻液由小球藻悬浮液和EM混合发酵而成，pH值3.0～3.5，主要有效成分为CGF（氨基酸；多肽；核苷酸；多糖；维生素等）和EM益生菌（光合细菌；乳酸杆菌；酵母菌；芽孢杆菌；放线菌群），有效活菌数＞1010个·mL－1。发酵过程对小球藻的养分组成也具有改善作用，主要营养成分变化如表1所示。

表1 小球藻和金藻液主要营养成分对比（DM基础）Table 1 Major differences on nutrients in NCS and FCS (on DM basis) （单位：mg·g－1）

1.2 试验设计

选择健康且体重相近的1日龄良凤肉鸡（公雏）480只，随机分为4组，每组各120只（每组设10个重复，每个重复12只）。以正大肉鸡料为基础饲粮，对照组正常饮水，试验组肉鸡每日分别在饮水中添加30 mL小球藻悬浮液、1 mL金藻液、30 mL小球藻悬浮液+1 mL金藻液。试验期为70 d。试验动物处理与分组如表2所示。

表2 试验动物处理与分组Table 2 Treatments and groups of broilers for experimentation

1.3 饲养管理

试验肉鸡采用笼养方式，试验期间自由采食和饮水，白天自然光照，夜间辅以人工补光，常规免疫。鸡舍通风良好，舍内温度与湿度保持稳定且适宜。

1.4 测定指标

1.4.1 血液免疫指标 70日龄，每组选取5只体重接近该组平均水平的肉鸡活体翅下静脉采血，血液3 500 r·min－1离心15 min，取上层血清，用酶联免疫吸附法（ELISA）分别对血清中IgA、IgG、IgM及免疫相关的细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和 IFN-γ的浓度进行测定（北京英华生物），详细实验 步骤参考试剂盒说明书。

1.4.2 免疫器官指数 试验肉鸡进行空腹屠宰。摘取脾脏和胸腺，用吸水纸擦干后称重，计算免疫器官指数。

胸腺指数=胸腺重（g）/活重（kg） 脾脏指数=脾脏重（g）/活重（kg）

1.4.3 组织切片制备及观察 称重后的脾脏和胸腺放入4%多聚甲醛固定液中固定。固定超过24 h后，对组织进行修块、脱水、透明、浸蜡、包埋，切片。脾脏与胸腺切片厚度均为6 μm，每隔20刀取一张切片，每个样品做10张重复。随后HE染色；苏木精染色40 s，伊红染色1 min；最后用中性树脂封片。选取5个视野进行图片采集。制作好的切片用Olympus系统显微镜分别在不同放大倍数下观察脾脏和 胸腺组织结构，每张切片均匀。

1.5 数据处理

利用Excel对试验数据进行整理，SPSS 21.0软件单因素方差分析差（One-way ANOVA）进行显著性分析，差异显著者，以LSD法比较平均数间的差异显著性。以P＜0.05为差异显著性标志，试验结果用 “平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫器官发育的影 响

2.1.1 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫器官指数的影响 如表3所示，添加小球藻悬浮液、金藻液及联用液对试验肉鸡的胸腺指数产生了显著影响（P＜0.05），对脾脏指数无显著影响（P＞0.05）。与对照组相比，试验组胸腺指数显著升高（P＜0.05），金藻液组与联用组显著高于小球藻组（P＞0.05），但金藻液组与联用组差异不显著（P＞0.05）。小球藻组、金藻液组和联用组脾脏指数与对照组无显著差异（P＞0.05）。

表3 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫器官指数的影响Table 3 Effects of NCS and FCS on broiler immune organ indices

2.1.2 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫器官组织结构的影响 如图1所示，对照组视野内脾小结数量较少，红髓占据面积居多（图1-A）；脾动脉周围淋巴鞘松散不发达，轮廓不清晰，脾小结形状不规则（图1-E）。与对照组相比，小球藻组脾小结数目较多，形状呈规则的圆形或椭圆形，白髓和红髓交界区域较明显（图1-B）；脾动脉周围淋巴鞘发达且轮廓较清晰（图1-F）。金藻液组脾小结形状规则，白髓和红髓界限明显，脾动脉周围淋巴鞘发达（图1-G）。联用组脾小结数量较多，形状规则，脾动脉周围淋巴鞘很发达（图1-H）。对照组胸腺小叶的皮质部较薄，面积偏小，髓质占总面积比例较大（图1-I）；皮质和髓质分界不明显，皮质部小叶间隔不清晰，间隔内仅见小的毛细血管分布，髓质内毛细血管不发达（图1-M）。与对照组相比，小球藻组皮质厚度有所增加，与髓质界限较为清晰（图1-J）；小叶间隔较明显，髓质内毛细血管较发达（图1-N）。金藻液组胸腺皮质厚度较对照组有所增加（图1-K）；皮质边缘淋巴细胞排列密集，髓质内毛细血管发达，可见典型胸腺小体（图1-O）。联用组胸腺小叶明显增大，间隔明显，皮质厚度较对照组和其他试验组均增加（图1-L）；皮质边缘淋巴系统发达，髓质内小体数目增多，毛细血管网非常发达（ 图1-P）。

图1 小球藻悬浮液与金藻液对肉鸡免疫器官组织结构的影响Fig. 1 Effect of NCS and FCS on tissue structures of broiler immune organs

2.2 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血液免疫指标的影 响

2.2.1 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清中免疫球蛋白含量的影响 由表4可知，添金藻液和联用液对肉鸡血清中IgG含量产生了显著影响（P＜0.05），对IgA和IgM含量无显著性影响（P＞0.05）。与对照相比，金藻液组与联用组IgG含量显著升高（P＜0.05），小球藻组无显著差异（P＞0.05）。小球藻组、金藻液组和联用组IgA含量与对照组无显著差异（P＞0.05）。金藻液组、联用组和对照组两两相比 差异不显著（P＞0.05）。

表4 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清免疫球蛋白含量的影响Table 4 Effects of NCS and FCS on serum immunoglobulin in broilers

2.2.2 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清中细胞因子含量的影响 由表5可知，添加小球藻悬浮液、金藻液和联用液对肉鸡血清中TNF-α、IFN-γ、IL1-β、IL-2、IL-4、IL-6的含量产生了显著影响（P＜0.05）。与对照组相比，联用组血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6含量显著降低（P＜0.05），IL-4含量显著升高（P＜0.05）。金藻液组血清中IL-1β、IL-6含量相比对照组显著降低（P＜0.05），IL-4含量显著升高（P＜0.05），TNF-α、IFN-γ、IL1-β、IL-2、IL-6含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。小球藻组除了IL-2以外，其他细胞因子含量较对照组均降低，但差异不显著（P＞0.05）。

表5 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清细胞因子含量的影响Table 5 Effects of NCS and FCS on serum cytokine in broilers

3 讨论

3.1 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫器官发育的影响

免疫器官指数是反应动物免疫功能的一个重要标志，通常认为，免疫器官指数增加是免疫器官发育良好，机体免疫功能增强的表现，而免疫器官指数下降是免疫器官发育不良，机体免疫受到抑制的表现[11]。免疫器官的组织结构也是反应免疫器官发育的一个重要指标，脾脏和胸腺组织的完全发育为淋巴细胞及行使其免疫功能提供了充分的组织基础，其发育的强弱，直接决定着禽类全身的免疫水平[12]。小球藻（干物质基础）蛋白质含量高达55%～65%，但具有细胞壁，因此动物对其蛋白的利用效率并不高[13]。有研究发现，小球藻通过微生物发酵不仅可以达到破壁效果，且通过益生菌代谢过程可将小球藻蛋白质分解转化为多肽和氨基酸，使发酵液中多肽、总氨基酸和必需氨基酸含量显著升高，从而使氨基酸利用率大幅度提高[14]。小球藻生长因子（CGF）中含有多种游离氨基酸、多肽、小球藻水溶性多糖（CWSP）、糖蛋白、维生素等成分，其中CWSP可促进机体器官细胞的生长和分裂，进而促进免疫器官的发育，增强机体的免疫能力[15－16]。EM由光合细菌、乳酸菌、酵母菌等多种益生菌组成，具有改善动物肠道菌群、促进动物的生长和提高免疫力等功能[17]。研究发现，给小鼠每天口腔灌服150 mg·（kg·BW）－1和75 mg·（kg·BW）－1的CGF，可增加小鼠胸腺和脾脏的重量[18]。本研究结果表明，小球藻悬浮液、金藻液和联用液均显著提高了肉鸡的胸腺指数，且改善了胸腺和脾脏的组织结构，与上述研究结果基本一致。其主要原因可能与小球藻和金藻液所含的CGF发挥的作用有关。本试验中金藻液组和联用组肉鸡的胸腺指数高于小球藻组，其主要原因可能有两个方面，一方面是因为金藻液中含有大量的益生菌，肉鸡饲粮中添加益生菌可以有效增强肉鸡的免疫功能，对免疫器官的发育也有显著的促进作用[19]。另一方面是因为金藻液中各种氨基酸含量远高于小球藻悬浮液，研究发现通过营养调控增加肉鸡饲粮中蛋氨酸、精氨酸和苏氨酸等的含量均可以促进免疫器官发育，增强肉鸡的免疫调节能力[20]。但具体原因有待进一步研究。

3.2 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清中免疫球蛋白含量的影响

免疫球蛋白是机体免疫系统的重要组成成分，其在血液中的含量是反映动物机体免疫功能的重要标志。IgG是体液免疫应答最主要的抗体，在血液中含量最高，占免疫球蛋白总量的75%；IgA 的主要作用是参与黏膜局部免疫；IgM主要在脾脏中产生，是机体免疫系统中的最大抗体，也是接触抗原后首先发生反应的第一抗体[21]。Kang等[22]研究发现，在肉鸡饲粮中添加1%新鲜小球藻液可以显著提高血液中白细胞的数量和血清中的IgA、IgG和IgM的含量。复合益生菌制剂可以显著提高肉鸡血清中的免疫球蛋白含量，从而增强肉鸡的免疫力[23]。本试验结果表明，3个试验组IgG、IgA和IgM含量都有所提高，这可能是小球藻水溶性多糖（CWSP）刺激了淋巴细胞使其对免疫球蛋白的分泌量增加所致[24]。而金藻液组和联用组IgG含量高于小球藻组，可能与其中益生菌的协同作用有关。

3.3 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清中细胞因子含量的影响

机体特异性免疫可分为细胞免疫和体液免疫，细胞免疫由T细胞分泌的一系列细胞因子介导完成。T细胞根据其分泌功能不同可分为Th1型和Th2型两类，Th1细胞分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α等细胞因子，主要在炎症过程、巨噬细胞激活和敏感性延迟等细胞免疫过程中发挥作用。Th2细胞分泌IL-4和IL-10等细胞因子，主要参与抗炎性过程，并辅助B细胞合成抗体。因此，血液中Th1型和Th2型细胞因子的水平可以直接反映动物机体的体液免疫和细胞免疫状态[25]。诸多研究表明，血液中IL-1、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α等细胞因子含量升高，会诱导氧自由基生成，造成体内重要脏器与组织的氧化损伤，引发炎症反应，从而降低畜禽的生产性能，而IL-4和IL-10等可抑制促炎性细胞因子的产生，缓解组织氧化损伤和炎症反应[26－27]。有动物试验发现，小球藻热水抽提物（CVE）通过激活巨噬细胞诱导Th1，从而调控细胞免疫过程中IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的分泌，使小鼠的免疫调节能力得到提高[17]。本研究结果表明，试验组肉鸡血清中促炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL1-β、IL-2、IL-6含量均降低，抗炎性因子IL-4含量升高。说明添加小球藻悬浮液和金藻液后肉鸡的免疫调节能力有所增强，与上述研究结果基本相符。诸多研究表明，EM中的益生菌可以作为非特异性免疫调节因子，诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞等产生细胞因子参与机体免疫调节活动[28]。因此，金藻液和联用液对肉鸡细胞因子的分泌调节机制可能也与其中益生菌调节的作用有关。

4 结论

添加小球藻悬浮液和金藻液均能促进肉鸡免疫器官的发育，提高免疫器官指数，改善免疫器官组织结构。提高肉鸡血清中免疫球蛋白的含量，抑制炎性细胞因子的产生，促进抗炎性细胞因子的合成，对肉鸡免疫功能具有一定的增强和调节作用。