猪精子核酸识别Toll 样受体的表达特性

章琳俐，李 丽，辛清武，朱志明，缪中纬，林长光,2，李兆龙，郑嫩珠

（1. 福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2. 福建光华百斯特生态农牧发展有限公司，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意义】Toll样受体（TLR）是天然免疫系统重要的模式识别受体之一，能够识别细菌脂多糖（LPS）、肽聚糖、未甲基化病原体的CpG DNA和病毒RNA等病原体衍生物并通过髓样分化蛋白88、β-干扰素TLR结构域衔接蛋白介导多种信号通路，继而引发特异性的免疫应答[1,2]。Toll样受体家族因其重要的免疫调控作用，已成为近些年研究的热点。精液可作为细菌和病毒向雌性动物生殖道传播的载体，进而传递给胎儿[3]。研究精子的天然免疫相关蛋白，有助于了解精液和精子的抗微生物特性，对畜禽的抗病育种研究具有重要科学意义和应用前景。【前人研究进展】哺乳动物中已经发现13种TLRs，其中TLR 1-9在人和鼠身上有功能表达，TLR10仅仅在人体内起作用；猪上也已克隆出TLR1-10基因[1]。根据细胞定位和病原相关模式分子（PAMPs）的类型，TLRs大体上分为两大类：第一类为TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要识别来自细菌、真菌和原生动物的PAMPs；第二类为TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，识别病毒和细菌的核酸衍生物。TLRs首次被报道存在于雄性大鼠附睾上皮及精子中[4]。鼠精原细胞和精母细胞TLR3，被激活后可启动生精细胞抗病毒的天然免疫反应，并可以诱导生精细胞凋亡[5,6]。人和鼠精子的TLR2和TLR4可识别病原组分脂多糖和肽聚糖引起精子运动减慢和精子凋亡[7,8]。小鼠精子TLR9激活也可导致精子活力及受精能力下降[9]。目前对精子中TLRs的研究多集中人和鼠，针对其他动物的研究报道较少[7,8,10]。【本研究切入点】TLRs在生殖系统的微生物广谱识别和清除中发挥重要作用。虽然猪雄性和雌性生殖器官已检测到TLRs的表达[11]，但在猪精子上关于识别核苷酸衍生物的TLRs尚待进一步研究。【拟解决的关键问题】本研究测定了猪精子TLR3、7、8、9基因的表达及TLR3蛋白在精子上的分布情况，为猪精子的抗微生物特性研究和TLR信号相关功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

分别采集3只长白公猪精液样本，经16层纱布过滤，检测精子活力和活率，精液与CXM按 1∶2稀释后，45°倾斜置于37 ℃ CO2培养箱1 h，取上层3/4部分2 500 r·min－1离心5 min，弃上清。PBS清洗2次，12 000 r·min－1离心1 min，收集精子立即用液氮速冻后置于－80 ℃冻存备用。另一部分经过洗涤后 制作精子涂片。

1.2 总RNA提取和反转录

采用Trizol法提取组织总RNA，超微量紫外分光光度计（Thermo Scientific，美国）检测RNA含量、纯度及质量，并调整总RNA含量至1 μg·μL－1；利用Super Script™ III First-Strand Synthesis Super反转试剂盒（Invitrogen，美国）将其反转录成cDNA，置于－ 80 ℃保存备用。

1.3 RT-PCR检测

根据Gen Bank已公布TLR3、7、8和9基因序列，应用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件设计引物（表1），生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以GAPDH基因为内参，Applied Biosystems Veriti PCR仪（Applied Biosystems Ltd.，美国）检测猪精子、脾脏和肺脏mRNA表达情况。反应体系（50 μL）：Platinum®PCR Super Mix，High Fidelity 45 μL（Invitrogen，美 国）、1 μg·μL－1cDNA 2.0 μL、10 μmol·L－1PCR-F 1 μL、10 μmol·L－1PCR-R 1 μL和ddH2O 1.0 μL。反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、X ℃ （溶解温度，见表1）30 s、68 ℃ 30 s 38个循环。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primers and conditions

1.4 免疫荧光试验

精子涂片自然风干后，经4%的多聚甲醛固定10 min，PBS洗 涤（0.02 mol·L－1, pH 7.2），5%BSA封闭，小鼠TLR3单克隆抗体（1∶250；Abcam，美国）4 ℃孵育过夜；精子涂片PBS漂洗后，用FITC标记的免抗鼠IgG荧光二抗（1∶100；北京博奥森，中国）37 ℃ 孵育1 h，PBS漂洗，甘油封片。阴性对照用PBS替代一抗孵育。封片后快速在荧光显微镜（ 尼康，日本）下观察，并进行数据和图像采集。

2 结果与分析

2.1 猪精子TLRs mRNA的表达水平

以脾脏和肺脏为阳性对照，利用RT-PCR检测了TLR3、7、8、9 mRNA在猪精子中的表达情况，如图1所示。结果显示：在理论大小处各组织均有单一清晰的条带，这一结果提示，TLR3、7、8、9 m RNA在猪精子、脾脏和肺脏中均有表达。

图1 猪精子TLRs mRNA的表达Fig. 1 mRNA expression of TLRs in porcine sperm

2.2 TLR3在猪精子上的分布情况

本研究选取mRNA表达量相对较高TLR3，通过免疫荧光的方法观察TLR3在猪精子上的分布情况，如图2、3所示。结果显示：TLR3定位于猪精子的头部后部对应核后帽区及中段。利用IPP6软件对荧光强度进行分析，显示核后帽区荧光强度强于中段（图4），而阴性对照中检测不到荧光信号。

图2 免疫荧光染色显示TLR3在猪精子的分布情况Fig. 2 Immunofluorescence of TLR3 in porcine sperm

图4 猪精子不同位置TLR3荧光强度Fig. 4 Fluorescence intensity of TLR3 at locations of porcine sperm

图3 TLR3在猪精子的分布Fig. 3 Localization of TLR3 in porcine sperm

3 讨论

精子从形成到与卵子结合过程中都有可能受微生物入侵[12]。因此有效的感应和抵抗微生物感染对维持动物生殖健康至关重要。猪精液中已检测到多种病原如口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒，并可导致公猪精子受精能力下降，甚至种公猪生精障碍[13,14]，提示猪精子可能存在相关受体对病毒感染做出反应。免疫系统和生殖系统可能看似截然不同，实则这两个系统之间存在复杂的联系。在输卵管、颗粒细胞、附睾等非免疫细胞都发现TLR家族成员，其不但具有天然防御的作用，还参与正常的生殖生理，影响精子的发生和成熟[15]。

本研究显示猪精子中表达TLR3、TLR7、TLR8和TLR9 mRNA。人、鼠和鸡等精子中都发现TLR3、TLR7、TLR8和TLR9 mRNA[9,10,16]。一些研究发现哺乳动物精子在雌性生殖道中可发生蛋白质合成[17]。精子中观察到的TLRs mRNA应该在精子核凝结之前产生，这些TLRs mRNA可能也在生殖道中翻译成蛋白并发挥识别病毒感染等功能。动物细胞TLR3、TLR7、TLR8和TLR9信号转导主要通过MyD88和TRIF两个途径介导天然免疫反应，它们通过核转录因子NF-κB、AP-1、IRF3和IRF7的激活，诱导多种细胞因子和IFNs的释放，以发挥抗炎症反应和抗病毒状态效应。除此之外，在精子上，Toshihiro等[9]研究表明小鼠TLR9被未甲基化的 CpG DNA激活后，精子活力和受精能力降低，并影响精子顶体状态，抑制牛血清白蛋白（BSA）诱导的精子获能。Takashi Umehara发现小鼠TLR7/8被配体激活后可选择性地抑制了携带X染色体精子（X-精子）的活力，而不改变Y-精子活力或顶体的形成[18]。在体外应用TLR7/8配体（R848）处理小鼠精子成功分离X精子和Y精子[19]。由此推测，猪精子上表达TLR7/8，也可能作为猪性别选择的工具，有待于进一步验证。

TLRs细胞定位的不同以及自身结构的差异，导致识别的病原PAMPs具有特异性。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于细胞质内小泡上，如内质网（ER）、内质体、溶酶体和内质体[20]。Megan等[21]研究发现TLR3在肠上皮细胞的不对称分布，使肠上皮细胞免疫反应出现极化现象。不同动物精子TLRs受体的分布存在差异。大鼠精子中TLR1～3、5、7～9分布于整个精子，无特异的分布模式[4]。小鼠精子TLR7和TLR8分别位于精子尾部和中段，TLR9位于顶体区域和中段[9,18]，且都可影响精子活力。本研究中TLR3定位于猪精子的头部后部及中段。头部核后部由单层膜构成的核后帽覆盖，该部位是精子最后与卵母细胞膜融合位点[8]。而中段是精子细胞器的主要分布区域，包含线粒体壳、致密纤维和轴丝，可为精子的代谢和活动提供能量。Zhu等[8]研究显小鼠TLR信号可通过影响线粒体膜电位的方式间接消耗ATP从而影响精子运动。猪精子TLR3分布于头部后部及中段，可能会对精子运动产生调控作用，从而降低微生物感染胎儿的概率。

4 结论

TLR3、7、8和9 mRNA在猪精子中均有表达；TLR3蛋白主要分布在精子头部的后部和中段，提示猪精子可能对病毒及其衍生物感染做出应答，TLR3激活后可能会对精子运动产生影响。