北亚热带日本落叶松不同改良水平群体的遗传多样性*

杜超群 孙晓梅 谢允慧 侯义梅

(1.林木遗传育种国家重点实验室 国家林业和草原局林木培育重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091； 2.湖北省林业科学研究院 武汉 430075； 3.建始县林业科学研究所 建始 445300)

日本落叶松(Larixkaempferi)原产日本，自然分布在本州岛中部仅200 km2的狭小范围内，经过百余年的人工引种在我国获得了极大的发展空间，在温带、暖温带及北亚热带亚高山区的广大区域均有栽植(马常耕等， 2008)。日本落叶松具有早期速生、成林快、易于栽培、适应性广等特点，已成为我国北方及南方亚高山地区的重要针叶造林树种 (马常耕， 1992)。

随着日本落叶松引种区域的南移，北亚热带亚高山区是我国最适引种区。该区在20世纪60年代初一个偶然的机会小面积引种日本落叶松获得成功， 1985年和1987年营建了3片落叶松种和种源试验林，其中包括来自黑龙江、吉林和辽宁共13个产地的日本落叶松资源，依此确立了日本落叶松在该区利用的主体地位； 在中日合作JACA项目的资助下， 1998年在该区营建了2片由日本引进的种源/家系试验林，包括来自6个产地84个天然林分的材料及来自日本各育种场、种子园的129个家系； 1988—1997年引进辽宁、山东和内蒙古初级种子园的建园优树，并在湖北当地早期引种的人工林中选择优树，利用这些材料嫁接建立了初级种子园(即一代育种群体)，在建园的同时(从1988年开始)陆续营造了不同批次的子代测定林； 2006年冬至2007年春对已达1/2轮伐期以上的11片子代测定林进行全面调查(共计12 707个单株)并选出优良单株， 2008年开始采穗、嫁接(共计285个单株，获成活苗木1.5万株)， 2012—2016年定植营建了育种园(即二代育种群体)(杨秀艳等， 2010)。日本落叶松在该区主要引种于海拔1 000～2 100 m的中高山地，在该海拔上杉木(Cunninghamialanceolata)和马尾松(Pinusmassoniana)等已不适宜栽种，曾经引种的华山松(Pinusarmandii)、油松(Pinustabulaeformis)也以失败告终，日本落叶松的成功引种填补了该生态区段主要造林树种的空白。

对育种资源的遗传基础进行系统全面的了解，维持合理的遗传多样性以及清晰的遗传背景，构建遗传品质不断提高且遗传基础不断拓展的育种群体，对于高轮次持续改良十分重要(李悦等， 2000； 康向阳， 2019)。国内外很多树种，如马尾松、杉木、油松、火炬松(Pinustaeda)、华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)等都开展了育种群体遗传多样性基础及多世代材料间遗传多样性动态变化的研究(冯源恒等， 2018； 欧阳磊等， 2014； 李悦等， 2000； Chhatreetal.， 2013； 于大德等， 2014)，为可持续的遗传改良提供了依据和指导。作为外来树种，我国也一直重视日本落叶松育种资源遗传基础的研究。易敏(2014)、刘昌勇(2016)等以引种种源群体为材料对生长、材性性状及分子水平的遗传变异开展研究，发现该群体具有丰富的表型变异及中等水平的分子遗传多样性； 陈兴彬(2016)以种子园及其子代群体为材料分析比较了亲本和子代群体的遗传多样性； 孙晓梅等(2003； 2004)开展了种子园自由授粉家系子代生长、形质与材性性状的遗传变异研究； 杨秀艳等(2011)尝试利用分子标记开展了二代优树群体的遗传基础评价。这些研究结果为日本落叶松遗传改良以及资源高效利用提供了理论支撑，但由于方法各异无法开展不同改良水平群体的分析与比较。随着育种向更高轮次发展，如何维持高选择强度下日本落叶松育种群体的遗传多样性，是育种者和良种应用单位更为关注的问题，同时也是后期育种策略制定与调整的重要依据。

本文以北亚热带引种的日本落叶松种源群体与经人工选择的一代和二代优树育种群体为研究对象，利用SSR分子标记技术开展不同改良水平育种群体遗传多样性评价，揭示群体遗传基础随遗传改良进程的变化规律，评价当前遗传改良策略对遗传基础的影响，探讨高轮次育种群体遗传多样性维持的有效方法，为后期育种策略的制定及可持续的遗传改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于湖北省建始县长岭岗林场日本落叶松国家良种基地，包括分别以引种种源试验林、一代种子园、二代育种园形式保存的引种种源群体(introduced provenance population，IP)、一代优树育种群体(first cycle breeding population，FP)和二代优树育种群体(second cycle breeding population，SP)(表1)。其中引种种源群体来源于日本原产地日本落叶松自然分布区内的6个种源84个天然林分的443个单株， 1995年引种育苗， 1998年造林(易敏， 2014)； 一代种子园建园优树大部分来源于辽宁草河口林场、朝阳林场和土壤研究所以及山东天麻、内蒙古旺业甸初级种子园，最初的建园优树均来自于辽宁早期引种的日本落叶松人工林林分，35株优树选自湖北当地1960年引种的日本落叶松人工林林分， 1988年至1997年嫁接定植，通过去劣疏伐共保留145个无性系(杜超群等， 2019)； 二代优树群体主要选自营建于湖北省当地的日本落叶松子代测定林(杨秀艳等， 2010)，子代测定林家系种子采自当地初级种子园及内蒙古、辽宁和山东省初级种子园，通过家系单株配合选择方式选出二代优树238株，此外还从日本引进的各育种场、种子园家系(引种及造林同种源群体)中选择优树47株，共计285株，于2012—2016年定植于育种园内。

1.2 试验方法

采集供试材料的新鲜嫩叶，硅胶干燥后带回实验室。利用改良CTAB法(杨秀艳等， 2011)提取基因组DNA，采用课题组前期开发的16对多态性较好的日本落叶松EST-SSR引物进行PCR扩增(Chenetal.， 2015； 2018)。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成(荧光修饰)，Taq酶、dNTP购自TaKaRa宝生物工程有限公司。PCR扩增采用15 μL体系，包括： dNTPs 1.5 μL(0.25 mmol·L-1)，Buffer(Mg2+plus)1.5 μL，Taq酶0.2 μL(5 U·μL-1)，上下游引物各0.6 μL(0.4 μmol·L-1)，模板DNA 1 μL，超纯水9.6 μL，其中基因组DNA模板的浓度为30～50 ng·μL-1。PCR扩增采用Touch down PCR程序： 95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性30 s，60～50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s， 20个循环，每个循环退火温度降低0.5 ℃； 95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，10个循环； 72 ℃延伸7 min后于4 ℃保存。

PCR 扩增产物在ABI 3730XL DNA测序仪上进行自动荧光检测，用GeneMarker 2.2.0软件对原始数据进行分析，将各峰值的位置与同一泳道GL 500分子内标进行比较，得出SSR 扩增产物的长度数值。

1.3 数据分析

利用GenAlex 6.41软件估算各遗传参数，包括每个位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、Shannon多样性指数(I)和群体多态性信息含量(PIC)，并进行分子方差分析(AMOVA)及主坐标分析(PCoA)。

2 结果与分析

2.1 SSR引物多样性

16对引物在全部873个样品中共检测到等位基因106个，每个位点的等位基因数2～18个不等，多态性差异较大，平均为6.7个。有效等位基因数在1.158～6.123之间，平均有效等位基因数为2.543。Shannon指数平均为0.979，PIC值平均为0.480，其中PIC<0.25的位点2个(HL391和HL339)，为低度多态性位点； 0.250.5的位点有8个，为高度多态性位点(表2)。说明这些标记能够较好地反映群体遗传多样性水平。

续表2 Continued

2.2 群体间遗传多样性比较

种源群体中共检测到87个等位变异，一代、二代群体中分别检测到82个和81个等位变异，少于种源群体，但一代和二代群体的有效等位基因数和有效等位基因占比(Ne/Na)均高于种源群体。3个群体相互比较发现，种源群体在QL386、QL322、OH299、H339及H217这5个位点的等位基因数最多，一代群体在Y27、QL397和H233这3个位点上的等位基因数最多，二代群体在H215和H46这2个位点上的等位变异数最多。进一步对3个群体16对标记的等位基因频率进行比较(表3，表中仅列出了等位基因频率差异明显的5个位点)，发现一代与二代群体的等位基因频率分布较为一致，而它们与种源群体则存在明显的区别。例如在位点Y27的等位基因E、QL397的等位基因K、QL375的等位基因B、H52的等位基因B和C以及QL386的等位基因H和J，一代、二代群体的频率高于种源群体； 而位点Y27的等位基因B、QL397的等位基因I、H52的等位基因D以及QL386的等位基因B和D在种源群体中的频率则更高。

表3 3个群体的等位基因频率比较Tab.3 Comparison of allele frequencies in three populations

3个群体的Shannon多样性指数(I)分别为0.911、1.017和1.009，多态性信息含量PIC值分别为0.432、0.484和0.488； 整体来看，一代、二代群体的平均观察杂合度Ho高于种源群体。这些都说明与种源群体相比，一代、二代群体的遗传多样性均有所提高，改良后的群体仍然维持了较高的遗传多样性水平。对3个群体16个位点的遗传多样性参数进行方差分析，结果显示群体间差异不显著(P>0.05)。

2.3 群体间遗传分化

基于所有位点的AMOVA分析结果(表4)表明： 遗传多样性主要存在于群体内，群体间仅占10%。采用Nei的方法计算3个群体间的相似性系数和遗传距离(表5)，种源群体与一代优树群体的遗传距离为0.073，与二代优树群体的遗传距离为0.075，这说明随着遗传改良的进行，种源群体与后续世代的遗传相似性逐渐减小，遗传距离有增大的趋势，但世代间的遗传分化程度不高，一、二代优树群体之间遗传相似性系数高达0.994。

表4 3个群体的AMOVA分析Tab.4 AMOVA analysis of three populations

表5 3个群体之间的遗传距离(左下角)与遗传相似性(右上角)Tab.5 Genetic distance (lower left) and genetic similarity (upper right) between populations

基于SSR遗传距离的PCoA分析结果如图1所示，3个群体中，一代优树与二代优树在图中分布的位置相近，重合区域较多，种源群体与另2个群体之间只有部分重合，偏离比较明显，说明种源群体与一代、二代优树群体差异较大，而一代、二代优树群体之间比较相似。

图1 3个群体基于SSR遗传距离的PCoA分析Fig. 1 PCoA analysis based on SSR genetic distance of three populations

2.4 引入种源群体对二代育种群体遗传多样性的影响

虽然二代育种群体的遗传多样性参数值没有降低，但遗传背景与种源群体相比仍存在较明显的差异，因此考虑将种源群体中与二代群体差异较大的基因型引入其中，以拓宽二代育种群体的遗传基础。选择种源群体中单株材积排名前50位，且与二代育种群体遗传距离较远的30个单株补充进入二代育种群体，群体规模从285个单株增加到315个。从图2中直观地看到，引入种源群体后二代育种群体在坐标中的分布范围明显扩大，遗传参数估算结果表明群体的有效等位基因数(Ne)从2.614提高至2.651，Shannon多样性指数(I)从1.009变为1.023，PIC值从0.488变为0.494，各参数均有所增加，说明引入种源群体可有效拓宽群体的遗传多样性。

图2 二代育种群体引入种源群体后的PCoA分布Fig. 2 PCoA distribution of second cycle breeding population after introducing provenance population

3 讨论

3.1 日本落叶松育种群体遗传多样性随遗传改良进程的变化

研究和评价林木育种系统的遗传多样性，对于林木育种的理论与实践都具有非常重要的意义(李悦等， 2000)。本研究利用16对EST-SSR标记比较和评价了北亚热带亚高山区日本落叶松引种种源群体、一代育种群体和二代育种群体的遗传多样性，其平均有效等位基因数为2.543，Shannon多样性指数为0.979，PIC值为0.480，遗传多样性略低于SSR标记的日本原产地同类研究结果(Hansen， 2008； Nishimuraetal.， 2011)，高于针叶树天然群体的平均值，高于报道的华北落叶松育种群体的相关值(于大德等， 2014)。总体来说，北亚热带地区日本落叶松育种群体具有较高的遗传多样性水平。

很多研究认为育种实践在有效提高改良群体的遗传增益的同时，由于加大了人为选择的强度，很可能降低了群体遗传多样性水平。实际上多个树种的研究发现遗传多样性变化不大，如Fageria等(2014)认为白云杉(Piceaglauca)人工表型选优群体的遗传多样性虽然较天然群体低，但差异不显著； Szmidt(1984)研究了欧洲赤松(Pinussylvestris)天然群体与种子园子代的遗传多样性，发现后者的多样性并没有显著下降； Chhatre等(2013)发现火炬松一代和二代育种群体期望杂合度和观测杂合度非常接近； 于大德等(2014)发现华北落叶松1～3代种子园遗传多样性略有增加，子代群体与亲代群体间分化较小； 而对于北美云杉(Piceasitchensis)的研究则认为改良群体的遗传多样性非但没有变小，反而还略高于天然群体(Chaisurisrietal.， 1994)。在火炬松(Isiketal.， 2019)、马尾松(冯源恒等， 2018)和油松(李悦等， 2000)等树种高轮次育种中，普遍认为在系统分析亲本育种值及育种群体遗传结构的基础上，有针对性地设计育种群体结构及制定选择策略，能够有效地兼顾遗传增益与遗传多样性，合适的育种措施还有可能对遗传多样性的提高起到促进作用。

本研究中日本落叶松3个群体的Shannon多样性指数分别为0.911、1.017和1.009，多态性信息含量PIC值分别为0.432、0.484和0.488，表明一代和二代育种群体的遗传多样性并不低于种源群体，该结果与北美云杉(Chaisurisrietal.， 1994)以及油松(李悦等， 2000)的研究结果类似。这一方面是由于本研究中种源群体来源于原产地35°30′—36°45′N、138°10′—139°45′E的区域(易敏， 2014)，从地理来源上看，该群体不足以代表天然群体的整体遗传多样性，这可能是改良后代遗传多样性略高于种源群体的原因； 另一方面，二代育种群体除了包括一代种子园子代测定林入选的优树外，还包括从日本各育种场、种子园引进的家系试验林中选出的47个单株，这可能包含一代群体所不具备的相关基因，也在一定程度上影响了等位基因频率的分布。本研究结果表明随着改良水平的提高，并未出现遗传基础变窄的问题，只要育种策略和措施得当，改良代群体仍可以具有较高的遗传变异水平，这一结果也进一步表明目前该区域日本落叶松遗传改良策略在维持遗传多样性方面是合适的。

虽然改良代群体与种源群体的遗传多样性参数值比较接近，但从等位基因频率比较和PCoA分析的结果可以看出群体间的遗传组成存在明显的差异。一代育种群体主要来自辽宁地区早期引种的日本落叶松人工林优树，与种源群体来源可能存在一定的差异。另外，落叶松属种间隔离不明显，日本落叶松在长期引种栽培过程中容易与长白落叶松(Larixolgensis)等其他乡土落叶松发生天然种间杂交，花粉污染会造成育种群体之外的基因交流(Chenetal.， 2018)，外来花粉携带的等位基因异于种源群体或者亲本群体(李悦等， 2000)，而这些杂种后代由于表现出较强的杂种优势极大可能被选择进入育种群体(杨秀艳等， 2011)。针叶树遗传改良主要采用轮回选择的方式，通过快速积累有利基因的频率来获取遗传增益(康向阳， 2019)，在高强度的人工定向选择压力的作用下，群体中的基因型频率也必然会发生一定程度的定向改变，人工选择同时还会造成部分等位基因的缺失(冯源恒等， 2018)。这些都可能是导致种源群体与改良代群体之间遗传基础存在差异的原因。

3.2 拓宽日本落叶松高轮次育种群体遗传多样性的策略

为提升高世代育种群体遗传多样性水平，常常从原始基本群体选择优树，引入原育种群体并不具备的相关基因，或者从育种区外引进优树资源，以弥补育种群体资源的不足(康向阳， 2019)。美国东南部湿地松(Pinuselliottii)与新西兰辐射松(Pinusradiata)遗传改良中，通过建立结构化的育种群体平衡遗传多样性和遗传增益，主群体中大部分的资源主要用于基因保存，随时准备补充进入精选群体； 火炬松二轮育种中则在未改良的人工林中选出新一批材料，作为育种群体中专门的遗传多样性群体，以保持广泛的遗传基础、获得长期遗传进展(Writeetal.， 2014)； 马尾松遗传改良中(冯源恒等， 2018)，利用核心种质对育种群体选择中损失的等位基因进行补充，有效避免了损失稀有等位基因。而对于外来引进树种，拓宽高世代育种群体的遗传基础更为重要。辐射松引入澳大利亚之后，一代育种群体主要选自早期引种的人工林，遗传基础相对较窄(Burdon， 1992)，在进入第3轮育种时，注重引入新的遗传资源，从5个原产地收集并通过种源试验研究的资源补充进入育种群体，明显提高了遗传多样性(饶龙兵， 2009)。

构建北亚热带亚高山区日本落叶松二代育种群体的过程中，在对营建于该区的一代育种群体子代测定林开展广泛选优的基础上，通过选择性地引入区域外的人工群体和天然群体资源的育种策略，一方面对引进的日本各育种场和种子园的优良家系的子代进行选优，另一方面尝试将引自原产地天然群体中遗传基础与国内改良代群体差异较大的部分优树补充进入二代育种群体中，有效地拓宽二代育种群体的遗传基础，确保长期遗传增益，有利于实现该区日本落叶松的持续遗传改良。

4 结论

北亚热带亚高山区日本落叶松引进的种源群体、一代育种群体和二代育种群体均具有较高的遗传多样性，一代、二代育种群体的遗传多样性与种源群体相比不存在显著差异，说明目前该区域日本落叶松的育种策略在维持遗传多样性方面是合适的； 种源群体与一代和二代育种群体间的遗传距离逐渐增大，但一代和二代育种群体间的分化不大，变异主要来源于群体内； 种源群体的遗传基础与一代和二代群体之间存在着明显的差异，将种源群体的部分优树补充到二代育种群体之中，可有效提高二代育种群体的遗传多样性水平，这对像日本落叶松这样的外来树种高轮次育种群体的构建尤为重要。