参芪地黄汤对糖尿病肾病模型大鼠肾组织中TGF-β1及VEGF表达的影响

瞿 飞 高金梅 赵 杰 廖加抱

（1.嘉兴市中医医院，浙江 嘉兴 314001；2.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；3.云南中医医院，云南 昆明 650021）

糖尿病可引起肾功能衰退，最终发展为糖尿病肾病（DN）。据统计，糖尿病患者中约有25%～50%会出现DN，长期的DN会发展为肾衰竭，严重威胁患者生命[1]。近年来研究发现，转化生长因子β1（TGF-β1）及血管内皮生长因子（VEGF）的异常表达是糖尿病出现肾损伤的重要机制之一，通过调控TGF-β1与VEGF表达，可改善DN患者肾功能[2-3]。近年来，中药治疗DN取得了十分显著的疗效[4-5]。参芪地黄汤最早记载于《杂病源流犀烛》，临床可用于治疗脾肾亏虚、气阴不足型DN[6]，但其缓解DN的作用机制尚不明确。本研究通过建立大鼠DN模型，灌胃不同剂量参芪地黄汤，观察参芪地黄汤对DN模型大鼠的治疗作用，同时检测大鼠肾组织VEGF及TGF-β1表达水平，探索参芪地黄汤缓解DN的作用机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购于北京华阜康生物科技有限公司。大鼠饲养于SPF级清洁环境中，自由进食，室温（22±2）℃。本研究经嘉兴市中医医院实验伦理委员会同意。

1.2 主要试剂及仪器 盐酸贝纳普利片（诺华制药有限公司）；高糖高脂饲料（斯贝福生物科技有限公司）；链脲霉素（STZ，Sigma）；血糖试纸（罗氏公司）；肌酐试剂盒、尿素氮试剂盒、尿蛋白试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；RNA提取、反转录、扩增试剂盒（天根生物科技有限公司）；兔抗鼠VEGF（货号：ab1316）和 TGF-β1（货号：ab15715）一抗，羊抗兔免疫组化二抗（货号：ab6721，Abcam）；多功能读板机（Thermo）；光学显微镜（Nikon ECLIPSE TS100）；荧光定量PCR仪（Bio-RADiQTM5）。

1.3 药物 参芪地黄汤药液制备：分别称取人参6 g、黄芪15 g、熟地黄15 g、山药15 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g、山萸肉9 g、生姜3片、大枣10枚（中药均购置于嘉兴市中医医院中药房），加入8倍量水浸泡2 h，煎煮2次，每次煎煮30 min，过滤药渣，将得到的药液浓缩至6 g生药/mL，4 ℃冷藏备用。盐酸贝纳普利药液制备：盐酸贝纳普利用去离子水配制成1.5 mg/mL的混悬液。

2 实验方法

2.1 分组与造模、给药 将60只大鼠随机分为正常组、模型组、西药对照组和参芪地黄汤低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组建立DN模型。采用高脂高糖饲料（配料为：67%正常饲料，20%蔗糖，10%猪油，2.5%胆固醇，0.5%胆酸钠）喂养大鼠6周，诱导出现胰岛素抵抗，腹腔注射枸橼酸钠溶解的STZ（剂量为35 mg/kg），注射后继续高糖高脂饲料喂养，持续12周[7]。注射STZ后，西药对照组和参芪地黄汤低、中、高剂量组每日分别灌胃盐酸贝纳普利1 mg/kg和参芪地黄汤4.5、9、18 g生药/kg，正常组和模型组每日灌胃等量生理盐水，均每日1次，连续灌胃12周。各治疗组处方量均按照《中药药理研究方法学》中，人与实验动物体表面积折算等效剂量比换算而来，其中中剂量组为人等效剂量。

2.2 指标检测

2.2.1 血糖 注射STZ后，各组大鼠每2周1次断尾采血，检测血糖水平，共12周。

2.2.2 肾功能生化指标 干预12周后，每只大鼠分别置于代谢笼中24 h，留尿期间禁食，自由饮水，收集各组大鼠24 h尿液，计算24 h尿量。之后对大鼠进行麻醉，主动脉取血，收集血清，运用试剂盒检测各组大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）含量，记录24 h尿蛋白水平。

2.2.3 肾组织病理表现 取大鼠左侧肾脏，用福尔马林溶液固定，常规脱水、透明、包埋、切片，HE染色，光镜下观察肾组织病理学变化并拍照。

2.2.4 荧光定量PCR检测肾组织中VEGF、TGF-β1 mRNA表达 取大鼠右侧肾脏，用试剂盒提取肾组织中总RNA，使用UV法检测每个样品中的总RNA浓度。将纯度合格的样本进行反转录合成cDNA，采用SYBR Green Real Time RT-PCR试剂盒对cDNA模板进行扩增，qPCR仪检测各组大鼠肾组织中VEGF及TGF-β1 mRNA表达，采用β-actin为内参，具体引物序列见表1。

表1 引物序列

2.2.5 免疫组化法检测肾组织中VEGF、TGF-β1蛋白表达 一抗稀释倍数：VEGF（1∶1000），TGF-β1（1∶2000）；二抗稀释倍数：1∶4000。光学显微镜下对肾组织免疫组化结果进行拍照，运用Image J软件对拍照后的图片中VEGF及TGF-β1阳性表达区域进行量化，计算出平均光密度[8]。

2.3 统计学方法 运用SPSS Statistics 17.0统计软件对各组大鼠检测指标进行统计分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，正态分布判断：小样本采用Shapiro-Wilk（SW）检验（P＞0.05为正态性），以及通过Q-Q图方法判断。计量资料符合正态分布且满足方差齐性检验，组间比较采用两独立样本t检验，两组以上采用单因素方差分析，若方差齐则采用LSD事后比较（两两比较），若方差不齐，则采用Dunnett T3进行两两比较。P＜0.05判断为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠血糖比较 造模开始后，与正常组比较，模型组和各给药组大鼠血糖均显著升高（P＜0.05）；药物干预12周时，各给药组大鼠血糖均明显低于模型组（P＜0.05）。见图1。

图1 注射STZ后各组大鼠血糖变化（±s，n=10）

3.2 各组大鼠肾功能生化指标比较 干预12周时，造模大鼠血清Cr、BUN及24 h尿蛋白水平均显著高于正常组（P＜0.05），各给药组上述指标明显低于模型组（P＜0.05），各给药组上述指标水平组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 干预后各组大鼠肾功能相关生化指标水平比较（±s）

表2 干预后各组大鼠肾功能相关生化指标水平比较（±s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 动物数/只 肌酐/（μmol/L）尿素氮/（mmol/L）24 h尿蛋白/mg正常组 10 45.74±8.71 3.58±0.41 11.58±4.41模型组 10 128.82±12.34# 16.77±2.64# 27.50±9.61#西药对照组 10 78.56±19.75#* 9.03±2.46#* 16.27±8.72#*参芪地黄汤低剂量组 10 102.52±25.41#*13.58±5.57#* 20.51±3.23#*参芪地黄汤中剂量组 10 96.49±20.05#*12.18±1.82#* 18.56±8.30#*参芪地黄汤高剂量组 10 81.59±18.46#*13.69±0.86#* 15.79±7.88#*

3.3 各组大鼠肾组织病理表现比较 模型组大鼠肾组织出现明显的炎细胞浸润及肾小球增生，肾小管明显扩张，肾小管上皮细胞空泡样变并伴部分肾小管上皮细胞坏死、脱落；西药对照组、参芪地黄汤中、高剂量组大鼠肾组织中炎细胞浸润、肾小球增生及肾小管上皮细胞坏死明显减轻，参芪地黄汤低剂量组大鼠肾组织中炎细胞浸润有所减轻，但仍伴有部分肾小管上皮细胞坏死、脱落。见图2。

图2 干预后各组大鼠肾组织病理表现（HE染色，×200）

3.4 各组大鼠肾组织VEGF及TGF-β1 mRNA表达比较 模型组大鼠肾组织中VEGF、TGF-β1 mRNA表达与正常组相比显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，西药对照组和参芪地黄汤中、高剂量组大鼠肾组织中VEGF mRNA表达显著下调（P＜0.05），各给药组大鼠肾组织中TGF-β1 mRNA表达显著下调（P＜0.05）；各给药组上述指标组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 干预后各组大鼠肾组织VEGF及TGF-β1 mRNA表达比较（±s）

表3 干预后各组大鼠肾组织VEGF及TGF-β1 mRNA表达比较（±s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 动物数/只 VEGF TGF-β1正常组 10 0.57±0.09 0.35±0.19模型组 10 1.00±0.05# 1.00±0.02#西药对照组 10 0.66±0.07*0.80±0.06*参芪地黄汤低剂量组 10 1.12±0.27# 0.71±0.23*参芪地黄汤中剂量组 10 0.68±0.16*0.57±0.18*参芪地黄汤高剂量组 10 0.75±0.06*0.62±0.09*

3.5 各组大鼠肾组织VEGF及TGF-β1蛋白表达比较 免疫组化结果表明，VEGF阳性表达区域主要位于肾小球上皮细胞与肾小球基底膜，TGF-β1阳性表达区域主要位于肾小管及肾小球间质。与正常组比较，模型组大鼠肾组织中VEGF及TGF-β1阳性表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织中VEGF阳性表达水平显著下降（P＜0.05），西药对照组和参芪地黄汤中、高剂量组大鼠肾组织中TGF-β1阳性表达水平显著下降（P＜0.05）；各给药组上述指标组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表4。

图3 干预后各组大鼠肾脏免疫组化染色（×200）

表4 干预后各组大鼠肾组织VEGF及TGF-β1免疫组化平均光密度值比较（±s）

表4 干预后各组大鼠肾组织VEGF及TGF-β1免疫组化平均光密度值比较（±s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 动物数/只 VEGF TGF-β1正常组 10 0.37±0.05 0.19±0.08模型组 10 1.13±0.16# 0.57±0.17#西药对照组 10 0.63±0.14#* 0.33±0.02#*参芪地黄汤低剂量组 10 0.71±0.18#* 0.38±0.10#参芪地黄汤中剂量组 10 0.65±0.05#* 0.26±0.08*参芪地黄汤高剂量组 10 0.58±0.15#* 0.23±0.04*

4 讨论

本研究结果表明，模型组大鼠血糖明显升高，说明发生糖尿病，且血清肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白水平均较正常组显著升高，提示肾功能出现损害，与DN患者临床血清生化检测结果相吻合；病理染色同样在模型组中观察到了明显的肾小球细胞增生、炎细胞浸润及部分肾小管上皮细胞坏死、脱落，这与DN的组织病理学变化相一致[1]。结合以上结果，提示DN模型建立成功。既往动物实验表明参芪地黄汤对DN大鼠具有一定的治疗作用[9]。此外，参芪地黄汤联合桃红四物汤可显著降低DN患者血糖，同时缓解DN患者肾功能生化指标[10]。我们研究同样表明给DN模型大鼠灌胃参芪地黄汤后，血糖降低，中剂量及高剂量可显著改善DN模型大鼠肾功能相关生化指标及肾组织形态，提示参芪地黄汤对DN具有明显的疗效。

肾脏中的VEGF和TGF-β1表达异常与DN密切相关，VEGF在肾小球足细胞、肾小管和集合管细胞中广泛表达，肾组织中的VEGF参与维持肾小球滤过功能，此外也有研究表明VEGF可调控足细胞活性。糖尿病患者长期的高血糖可损害肾小球及肾小管细胞内皮细胞，从而使肾组织中VEGF表达异常，过度表达的VEGF可促使上皮细胞形成血管环，损伤肾小球的滤过功能。此外，VEGF的过度表达也是导致DN蛋白尿的重要原因之一[2]。本研究观察到模型组大鼠肾组织有明显的肾小球增生，同时模型组大鼠24 h尿蛋白显著升高，提示肾小球滤过功能损伤。qPCR及免疫组化结果表明模型组大鼠肾组织中VEGF表达显著上调，表明肾组织中VEGF的上调是引起DN模型大鼠肾小球滤过功能损害及肾小球增生的机制之一。此外，高血糖可促使肾组织中TGF-β1表达升高，进而促使肾组织中细胞外基质的黏附与过度沉积，可引起肾小球增生硬化及肾小管纤维化，同时也可加剧肾组织中炎症反应[3]。下调肾组织中TGF-β1表达可缓解DN[3，11]。本研究观察到模型组大鼠肾组织出现明显炎细胞浸润，同时伴有TGF-β1表达的升高，提示TGF-β1表达的上调可能是引起DN大鼠肾组织炎症反应的机制之一。参芪地黄汤可显著降低DN模型大鼠肾组织中VEGF、TGF-β1基因及蛋白水平，表明参芪地黄汤可通过降低DN模型大鼠肾组织中VEGF和TGF-β1表达，改善肾小球滤过率及肾组织炎症反应，进而发挥治疗DN的作用。

综上，参芪地黄汤对DN模型具有明显的疗效，且能明显改善肾组织病理表现，推测其可能的作用机制与降低肾组织VEGF和TGF-β1表达有关。各给药组的作用效果比较未见统计学差异，考虑与样本量小或样本误差有关，并不能说明参芪地黄汤能替代盐酸贝纳普利，参芪地黄汤低剂量组对VEGF、TGF-β1基因及蛋白表达效果不一致亦可能为样本误差，均需进一步研究。