艾灸 “足三里” 和干姜水提取液对正常大鼠胃能量代谢作用机制差异研究＊

陈丽梅，王 慧，张高传，刘红宁＊＊

（1.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心 南昌 330004；2.江西省中医病因生物学重点实验室 南昌 330004；3.江西中医药大学高等研究院 南昌 330004）

艾灸是艾绒燃烧作用于机体特定的穴位，通过光、热、芳香效应及燃烧灰烬等综合作用，通过对机体的血液运行[1-5]、神经内分泌功能[6]、能量变化[7]、抗自由基[8]等作用调节机体的生理和心理，起到保健和治疗疾病的功能。艾绒燃烧时会释放出远红外和近红外光谱，远红外主要通过传导扩散热量，近红外可直接穿透到机体深层组织，使组织电子发生迁移，在这个过程中会产生大量的能量，同时将能量从一处传到另一处，为细胞代谢和免疫功能提供能量基础。研究发现，适宜温度刺激可提高内皮细胞能量物质，提升其生长活力[9]，说明艾灸可引起细胞的能量变化。而能量代谢是机体物质代谢的基本形式，是维持机体生命活动的物质基础。足三里穴为足阳明胃经的合穴，胃经气血在此处形成较大的气血场，具有燥化脾湿，生发胃气之效。以前的临床和实验研究都是以疾病为载体，然而艾灸足三里除了可以作用于疾病状态，对正常机体也有益处。我们想知道艾灸足三里后，其对正常大鼠胃组织能量相关因子的影响，以及影响能量代谢的相关代谢物基础，同时为艾灸温热特性提供理论依据。干姜，性热，主入脾胃经，具有补脾阳作用。研究发现，热性中药可增强机体能量代谢[10-11]。本文通过比较艾灸 “足三里” 和干姜对胃组织能量代谢作用机制差异，来窥探体外艾灸补阳和口服药物补阳之间的异同。代谢组学是系统生物学的重要分支，可从整体上反映机体的受外部刺激后，机体出现的微妙代谢变化。故本文采用代谢组学的技术，探讨艾灸足三里穴和干姜对胃组织能量代谢的影响及其作用机制。

1 方法

1.1 干姜提取液的制备

称取干姜1 kg，加10倍量纯净水浸泡60 min，快速加热至微沸后开始计时，加热回流提取1 h，过滤，剩余药渣加入8倍量纯净水加热至微沸后继续加热回流40 min，合并2次滤液，真空浓缩至1 g·mL-1，-20℃保存备用。

1.2 实验动物

健 康Sprague Dawley（SD）大 鼠24只（Specific pathogen Free，SPF级），雄性，体质量（160±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（湘）2016-0002。实验动物饲养条件：SPF级动物房，相对湿度为55%-65%，温度在（24±2）℃，照明条件为光照-黑暗交替各12 h，自由饮水。艾条（艾绒比8∶1，直径8 mm）购于江西鄱艾生物科技有限公司。普通饲料购于江西中医药大学动物中心。大鼠适应性喂养1周后，将大鼠随机分为3组，分别为空白对照组、艾灸足三里组、干姜组。艾灸组将大鼠固定在大鼠固定器上，根据大鼠喜暗的习性，蒙住大鼠的双眼，以便减少运动。艾灸双侧足三里，每天1次，每次 15 min，并灌胃生理盐水，连续4周；干姜组每天灌胃生药1.05 g·kg-1的干姜水提液，并除了不艾灸，其他过程和艾灸组一样，对照组除了不艾灸，其他过程均与艾灸组和干姜组一致。

1.3 样品的收集

实验结束后，大鼠禁食不禁水12 h。大鼠麻醉后，腹主动脉取血，将血液在室温下静置2 h-3 h，4℃条件下3500 rpm离心10 min。取血结束后，取胃组织，放入液氮中猝灭，然后转移至-80℃冰箱保存，备用。每个实验指标均选取同一部位的组织进行检测。

1.4 大鼠胃组织Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP、Mg2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SDH活性的测定

准确称取0.1 g胃组织，加入9倍量的生理盐水，制成10%的匀浆液，1500 rpm离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书进行。

1.5 体质量变化和体温变化

称量实验前和实验结束后所有大鼠的重量及测量实验前后肛温。

1.6 肝肾功能的影响

按照试剂盒说明书检测大鼠血清AST、ALT、Cr、BUN、UA。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.7 代谢组学样品的处理

将血清从-80℃冰箱中取出，在4℃条件下解冻。取50μL血清，加入150μL甲醇，涡旋2 min使其完全混匀，在低温下放置3 h。然后，将血清在4℃条件下以15000 rpm离心10 min，吸取上清液并离心浓缩使其干燥。将残渣用甲醇∶水=（15∶85）溶解，混匀。取上清液用于UHPLC-Q-TOF/MS分析。从每个样品中取出10μL，并混合在一起作为质量控制样品，每5个样品注入一针质控样品以监控整个实验。LC-MS的总离子色谱法在正负扫描模式下进行。

1.7.1 色谱条件

ACQUITY UOLCBEH C18（1.7μm，2.1 mm×5 mm，Waters公司），使用Agilent 1200 System（美国安捷伦）进行色谱分离。自动进样器保持在4℃，色谱柱温度在35℃。流速保持在0.3 mL·min-1。UPLC流动相由0.1%的甲酸水溶液（溶剂A）和乙腈（溶剂B）组成。梯度洗脱的步骤如下：0 min-6 min，2%-20%B；6 min-8 min，20%-40%B；8 min-12 min，40%-67%B；12 min-22 min，67%-100%B；22 min-23 min，100%-2%B，23 min-24 min，2%-2%B。

1.7.2 质谱条件

Agilent 6538飞行时间质谱仪对血清样品进行正负离子模式分析。采用Dual ESI源，正负离子源模式下：毛细血管电压（Capillary voltage）4000 V（正模式），3500 V（负模式）；雾化器压力30 psig；干燥气流10 L·min-1；干燥气温度300℃，碎片电压（Fragmentor）175 V；锥孔电压65 V，仪器采用参比自动校正，参比液速度为55 ul·min-1，参比离子质荷比为121.05973和922.09798。

1.7.3 数据采集和数据分析

运用Profinder B.0 6.0对原始数据进行预处理，首先采用无监督的主成分分析（Principal component analysis，PCA）对数据进行分析，进行Student’st-检验和方差分析以及数据转换分析（FC），满足P<0.05且FC>2的变量作为潜在生物标志物。如果PCA分析分离不好，则选择PLS-AD进行分析，将VIP>1、P<0.05和FC>2作为生物标志物的筛选条件。

将分析得到的分子量和保留时间，结合METLIN（http://www.metlin.scipps.edu）、HMDB（www.hmdb.ca）等数据库，对化合物的结构进行鉴定，将最终得到的鉴定物输入 MetaboAnalyst 4.0（http://www.metaboanalyst.ca/faces/ModuleView.xhtmL）分析平台进行代谢通路分析。

1.8 统计分析

使用SPASS17.0统计软件，通过单因素方差分析（ANOVA）对结果进行统计学分析，P<0.05被认为具有统计学意义。所用数据均用±s表示。

2 结果

2.1 体质量、体温变化

与空白对照组相比，艾灸足三里组和干姜组大鼠的体温没有显著性变化（P>0.05），体质量显著下降（P<0.01）（表1）。

表1 艾灸足三里大鼠体质量体温变化(n=8,xˉ±s)

2.2 艾灸足三里和干姜水提液对肝肾功能的影响

结果显示，与空白组对照组相比，艾灸足三里组及干姜组大鼠ALT、AST、UA、BUN、Cr没有显著性变化（P>0.05），说明连续艾灸足三里及给予干姜水提液对正常大鼠的肝肾功能没有显著影响（表2）。

表2 艾灸足三里和干姜水提液对肝肾功能影响(n=8,xˉ±s)

2.3 艾灸足三里和干姜水提液对胃ATP酶活性、SDH活性的影响（n=8，xˉ±s）

与空白对照组相比，艾灸足三里组能提高正常大鼠胃Na+-K+-ATP酶，Mg2+-ATP酶，Ca2+-ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，且都达到显著水平（P<0.01）。干姜组大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶没有显著性差异（P>0.05），可显著提高Mg2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性（P<0.01）。说明艾灸足三里和给予干姜水提取液后，大鼠的能量消耗增加。

同时，与空白对照组相比，艾灸组和干姜组大鼠胃组织SDH活性也显著提高（P<0.01）。（图1）。由结果可知，艾灸 “足三里” 和给予干姜水提液既增加大鼠的能量消耗也增加了能量生产，影响机体的能量代谢。

图1 艾灸组及干姜组对胃ATP酶、SDH活性的影响

2.4 艾灸足三里和干姜水提液对大鼠血清代谢模式的影响

PCA结果显示，艾灸足三里组和干姜组在正离子模式下两组代谢物分离的较好，组内聚集程度较好，说明艾灸 “足三里” 及灌胃干姜水提液后大鼠的内源性物质与正常对照组相比发生了显著性的变化。负离子模式下，两组代谢物分离不是很好，故对数据进行PLS-DA分析，在PLS-DA模式下，两组代谢物分离效果较好（图2、图3）。

图2 艾灸足三里组代谢模式图

图3 干姜组代谢模式图

2.5 潜在生物标志物的筛选及鉴定

通过代谢物精确的质荷比和同位素比例，从正离子模式下提取m/z 544.3401的离子，得到相应的保留时间和色谱峰，通过分子特征提取，分子式在MassHunter中得分比较高，在二级质谱中主要有m/z 86.0980、m/z 184.0751、m/z 258.1111、m/z 287.2373、m/z 361.2758、m/z 526.3298的碎片，通过HMDB数据库鉴定内源性代谢物，将二级质谱的碎片与HMDB数据库的碎片进行匹配，发现与2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱的标准化合物图谱最吻合，因此被鉴定为2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱（图4）。用上述方法最后鉴定了艾灸 “足三里” 后有5个潜在生物标志物，分别为N-乳代亮氨酸、2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱、PC(20:2(11Z,14Z)/14:0)、异亮氨酸、D-谷氨酰胺，其中异亮氨酸、N-乳酸酰亮氨酸、D-谷氨酰胺含量下降，2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱、PC(20:2(11Z,14Z)/14:0)含量升高。给予干姜提取液后有5个潜在生物标志物，分别为黄嘌呤、视黄酯、2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱、花生四烯酸、3-羟胆酸，其中2-花生四烯酰甘油磷酸胆碱含量升高，视黄酯、花生四烯酸、嘌呤含量下降。

图4 2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱二级质谱图

2.6 生物标记物代谢通路分析

将已鉴定的生物标记物导入MetaboAnalys 4.0进行Pathway Analysis分析，结果显示，艾灸足三里穴涉及的代谢通路包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成和降解、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、氨酰基-tRNA的生物合成，其中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，甘油磷脂代谢为主要的代谢途径。给予干姜水提液涉及的代谢通路为视黄醇代谢、花生四烯酸代谢、嘌呤代谢、不饱和脂肪酸代谢的生物合成（图5）。

图5 对机体代谢途径的影响

3 讨论

在特定穴位上艾灸会出现明显的温度传导，如果穴位局部温度升高，热量会在血液中传递[12]，推测艾灸可能是通过加热补充细胞的能量。卢圣锋等认为，艾灸在引起组织温度变化的过程，实际上就是能量传递的过程[13]。从整体观上来说，能量代谢是生命系统的基本过程，而热是能量代谢的重要表现形式[14]。能量代谢包括能量的产生和利用两方面。ATP（腺苷三磷酸）酶与能量的利用有密切的关系[15]。细胞膜两侧的离子浓度及离子转运需要利用能量来维持，ATP酶活性升高的同时也增加ATP的利用。艾灸足三里和给药干姜均可提高胃的ATP酶活性，说明体外输入热量和口服热性干姜均可增加机体胃组织能量消耗。SDH（琥珀酸脱氢酶）是三羧酸循环中的重要的酶，其活性升高说明三羧酸循环加快，能量生成升高。艾灸足三里和给药热性中药干姜后，SDH活性升高，说明两种方式均能促进机体三羧酸循环，使机体能量产生增加。

代谢组学结果显示，艾灸足三里主要通过氨基酸代谢、脂质代谢来影响胃的能量代谢。N-乳代亮氨酸是苯丙氨酸的乳酰基衍生物，是乳酸和亮氨酸通过逆蛋白水解快速形成，其在血清内水平与乳酸和亮氨酸的水平强烈相关。亮氨酸和异亮氨酸属于支链氨基酸，是潜在的营养信号分子。亮氨酸可调节糖代谢、脂肪合成与分解，提高胰岛素敏感性，促进能量代谢[16-18]，参与机体产热等重要的生物学过程。研究表明，脂肪组织通过改变GLUT4（葡萄糖转运蛋白4）表达而引起支链氨基酸酶表达变化，和协同分解循环BCAA（支链氨基酸），从而能够调节支链氨基酸的水平[19]。在健康的大鼠中，支链氨基酸吸收和氧化发生在多个不同的组织[20]，其一旦进入细胞，BCAA既可以储存在氨基酸池，也可以被整合到蛋白之中，或者被送到线粒体中进行氧化，也可用于合成酮体和葡萄糖。BCAA在BCATc（胞质支链转氨基转移酶）和BCATm（线粒体支链氨基转移酶）的催化下发生可逆的转胺反应生成BCKAs（支链α-酮酸）。BCAT（支链氨基转移酶）的表达受到转录因子KLF15（糖皮质激素激活）和PGC-1α（过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α）的调控。BCKAs进入多亚基酶复合物BCKDH（支链酮酸脱氢酶）氧化反应，该酶的亚基BCKDHA和BCKDHB受PGC1-a和PPAR（过氧化物酶体增殖剂激活受体）家族蛋白的正向调节。线粒体解偶联蛋白2和解偶联蛋白3正向调节BCAAs[21]。BCAT催化氨基从BCAAs转移到α-酮戊二酸形成谷氨酸，然后与丙酮酸结合，通过丙氨酸氨基转移酶生成丙氨酸，参与到TCA循环中。BCAA的水平会影响TCA（三羧酸循环）循环的中间体，从而影响能量代谢。另一方面，支链氨基酸在酮酸脱氢酶的催化下形成BCacyl CoA（支链酰基辅酶A），通过琥珀酰辅酶A参与TCA循环，影响机体的能量代谢[22]（图6）。本实验中，支链氨基酸含量下降，可能在艾灸过程中有更多的支链氨基酸作为底物形成生酮参与到TCA循环中，调节组织能量代谢。此外，BCKDH表达减少与体重和肥胖呈显著负相关[21]。艾灸胃经后支链氨基酸，乳酸含量降低揭示艾灸可能促进胃组织细胞有氧氧化，相对减少无氧糖酵解而提高机体能量代谢。

图6 BCAA及其分解代谢酶与营养物质及代谢途径的相互作用

谷氨酰胺是人体中含量比较多的氨基酸，它是神经系统中谷氨酸类神经递质的前体[23,24]，可增加肠道血流量和耗氧量，对维持胃肠黏膜的完整性发挥重要的作用[25]。研究发现，在正常和缺氧条件下，谷氨酰胺驱动的氧化磷酸化是转化为哺乳动物ATP的主要来源[26]。谷氨酰胺可用于生产烟酰胺、腺苷磷酸、核苷酸、嘌呤、抗氧化剂以及维持细胞的完整性。机体在营养不良、体育锻炼恢复等分解代谢条件下，利用谷氨酰胺的比率高于或等于葡萄糖的比率[27,28]。人体内谷氨酰胺通过激活细胞外信号激酶和C-Jun末端激酶来调控免疫细胞的增殖[29]，如白细胞利用谷氨酰胺作为能量底物，参与组织的修复过程[30]。在中性粒细胞中，谷氨酰胺对于避免中性粒细胞中NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷）氧化酶活性的改变和肾上腺素引起的过氧化物酶的产生具有重要意义[31]。谷氨酰胺代谢过程中产生的TCA循环代谢物，如柠檬酸、琥珀酸、富马酸等，在适应性和先天性免疫中参与炎症控制和内在免疫反应[30]。研究发现，以自然杀伤细胞系（NK-92）为培养对象，加入一定浓度谷氨酰胺后，培养一段时间后，谷氨酰胺浓度显著下降，NK-92显著扩增且促进胞内ATP生成[32]。艾灸足三里4周后，谷氨酰胺含量下降，可能是谷氨酰胺作为底物，通过谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路参与到TCA循环中，为机体ATP合成和消耗及提升机体免疫提供物质基础。

2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱是甘油磷酸胆碱家族成员，甘油磷酸胆碱（GPC）是卵磷脂分解而来[33]，由磷酰基、甘油和胆碱组成[34,35]，它不仅是磷脂代谢的中间产物，而且是合成磷脂酰胆碱和乙酰胆碱的前体物质。研究发现，当机体使用储存的脂肪作为能量来源时，甘油会被释放到血液中，然后转化葡萄糖，为细胞的新陈代谢提供能量[36]。胆碱是一种重要的营养物质，有助于维持细胞膜结构的完整性、甲基代谢、跨膜信号、脂-胆固醇运输和代谢以及正常大脑的发育[37]。研究发现，GPC摄入有助于衰老相关的现象（味觉敏感性和能量调节），同时对脂质代谢产生积极的影响[38]。本实验研究，艾灸足三里可增加2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱含量，提示艾灸足三里调节能量代谢和发挥其延缓衰老作用可能与脂质代谢相关。

热性中药干姜主要通过视黄醇代谢、脂质代谢和嘌呤代谢通路影响胃的能量代谢。影响视黄醇代谢的差异代谢物为视黄酯，其在一定条件下可分解为视黄醇和视黄酸。研究发现，视黄醇（维生素A）是激活线粒体蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）的重要辅助因子[39]，结合位点定位于Raf和蛋白激酶C家族的调控域，特别是锌指结构域，也包含他们的激活中心，其通过氧化还原作用激活PKC，蛋白激酶被激活后一方面通过增加乙酰辅酶A（acetyl-CoA）的产量，进而刺激PDH（丙酮酸脱氢酶）复合物[40-41]，增加丙酮酸的利用率[42]，从而促进线粒体内氧化磷酸化，导致线粒体耗氧量和ATP合成增加；另一方面维生素A线粒体中其电子载体的作用，与PKC（蛋白激酶）结合后可以加快电子的传递，进而促进氧化磷酸化进程。在本实验中，视黄酯含量下降，推测视黄酯可能通过自身消耗，促进线粒体氧化磷酸化过程。影响脂质代谢的差异代谢物花生四烯酸。花生四烯酸可通过PKC/AMPK信号传导激活脂肪细胞，降低脂肪水平。影响嘌呤代谢的差异代谢物是黄嘌呤。黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶氧化次黄嘌呤的产物之一。体内90%的次黄嘌呤可以通过修复作用再利用形成次黄嘌呤核苷酸。嘌呤核苷酸循环可通过提高AMP（一磷酸腺苷）活性、脱氨和参与三羧酸循环来调节能量代谢[43]。实验发现黄嘌呤含量下降，推测可能次黄嘌呤通调节TCA循环来影响能量代谢。

本研究发现，体外艾灸 “足三里” 和口服热性中药干姜均可影响胃组织的能量代谢。艾灸可提高正常大鼠的能量代谢相关因子的活性，体现了艾灸的温热特性及补阳特点。其影响这些特性的机制主要是通过调节氨基酸代谢，脂质代谢，其中氨基酸代谢主要是通过相关的物质生成生酮，进而参与到三羧酸循环中去，从而影响能量的代谢。热性中药干姜主要通过视黄醇代谢、脂质代谢、嘌呤代谢调节能量代谢。