香连丸中8种功效成分在小鼠体内的组织分布＊

刘昌顺，胡艳楠，夏 婷，罗振业，陈飞龙，谭晓梅

（南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室广东省中药制剂技术工程实验室 广州 510515）

香连丸（Xianglian Pill，XLP）源于《太平惠民和剂局方》，由萸黄连（按黄连与吴茱萸10∶1质量比炮制）和木香组成，具有清热燥湿、行气止痛之功效，方证相应，主治大肠湿热证，临床对溃疡性结肠炎、肠易激综合征等消化道疾病疗效显著[1]。近年来对XLP的研究报道主要集中于药理药效方面，发现XLP可以减轻肠道黏膜炎症，缓解肠道痉挛性疼痛，发挥药理效应的成分主要为生物碱类和内酯类[2,3]。目前XLP成分的体外解析工作已有相关报道，检测成分包括小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯等，然而这些成分口服后在体内的处置过程如何，至今研究报道甚少[4]。鉴于XLP多成分多药理途径改善大肠湿热证的作用，推测方药口服后其不同效应成分经过肠道滞留、吸收入血、代谢转化等体内不同处置过程，分布蓄积于不同脏器组织，从而整体发挥方药药效。因此本研究基于XLP成分的药理效应和含量及仪器检测灵敏度的考虑，选择君药萸黄连中小檗碱、黄连碱、吴茱萸碱等6个生物碱类成分，臣药木香中木香烃内酯和去氢木香内酯2个内酯类成分，UPLC-MS/MS检测上述8种成分的组织浓度，研究其体内分布特征，为XLP作用机制提供实验依据。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

G6410型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源和MassHunter B.04.00数据处理系统，（美国Agilent公司）；Agilent1290超高效液相色谱系统（美国Agilent公司）；HC-3018R型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；KQ5200D超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D型十万分之一天平（德国Sartorius）。

1.2 试剂

黄连（批号H3668231，产地四川）、吴茱萸（批号W2519813，产地湖南）、木香（批号M3819311，产地四川）购于广东省药材公司中药饮片厂。香连丸，实验室自制。盐酸小檗碱，盐酸黄连碱，盐酸巴马汀，盐酸药根碱，吴茱萸碱，吴茱萸次碱，木香烃内酯，去氢木香内酯和联苯双酯（内标物，IS）对照品（纯度>97%），均购于中国药品生物制品检定所。色谱级别甲醇和乙腈购于德国默克公司，水，甲酸，以及其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

（20±2）g的Kunming小鼠24只，购于南方医科大学实验动物中心（SCXK（粤）2016-0041）。

2 试验方法

2.1 动物实验

实验动物适应性喂养3天后，随机分为4组（n=6）。小鼠灌胃给予XLP（1.6 g·kg-1，相当于56.58 mg·kg-1黄连碱、201.48 mg·kg-1小檗碱、20.24 mg·kg-1药根碱、42.14 mg·kg-1巴 马 汀、0.80 mg·kg-1吴 茱 萸 碱、0.55 mg·kg-1吴茱萸次碱、5.72 mg·kg-1木香烃内酯、8.58 mg·kg-1去氢木香内酯）。分别于给药后0.5 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h处死小鼠，取小肠、大肠、肝、心、肺和肾，生理盐水冲洗干净后-80℃保存待测。

2.2 样品处理

称重组织样品0.2 g，加入4倍量甲醇匀浆，4℃下4500 rpm离心10 min，取上清液，精密加入内标工作溶液（1μg·mL-1联苯双酯甲醇溶液）20μL，震荡30 s，氮气流下吹干。残留物用200μL乙腈复溶，震荡2 min，4℃下15000 rpm离心10 min，取上清液进行UPLCMS/MS检测分析。

2.3 仪器分析条件

2.3.1 色谱条件

通过UPLC-MS/MS对XLP中8种活性成分进行分析，使用ACE Excel 3 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3μm）和流动相0.1%（v/v）甲酸水（A）和乙腈（B）进行洗脱，0.0 min-3.0 min：25%-30%B；3.0 min-5.0 min：30%-40%B；5.0 min-7.5 min：40%-45%B；7.5 min-8.0 min：45%-25%，流速0.3 mL·min-1，柱温：25℃；进样量：10μL。

2.3.2 质谱条件

离子源：ESI源；毛细管电压：4000 V，雾化器压力：30 psi；干燥气流温度：350℃；干燥气流速度：8.0 L·min-1；碰撞气微高纯氮气。采集模式：多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式。分别采用全扫描、选择性离子扫描和子离子扫描模式，确定各化合物的母离子和子离子，得到待测成分及IS的最优MRM参数（表1）。

表1 香连丸中8种功效成分及内标物的MRM参数。

2.4 方法学考察

2.4.1 对照品溶液的制备

分别精密称取8种XLP功效成分对照品适量，甲醇溶解，配制质量浓度为1.0 mg·mL-1的储备液。配制对照品混合溶液，稀释后得到系列浓度的对照品梯度溶液，用空白肝组织匀浆液制备标准曲线和质量控制样本。

2.4.2 方法学考察

以肝组织匀浆液为代表性基质，分别进行样品专属性，标准曲线，精密度，准确度，回收率，基质效应和稳定性试验，确认分析方法的可行性。分别以空白组织匀浆液，含有对照品组织匀浆液和实验样品进行方法的专属性考察。精密移取对照品混合溶液，以分析物浓度为横坐标（X），各分析物与IS峰面积比值为纵坐标（Y），以1/X作为权重，用加权最小二乘法线性回归运算绘制标准曲线。以高、中、低浓度的质控样品液，日内连续进样6次，日间连续进样3天，以RSD%计算精密度，以RE%计算准确度。质控样品进样后所得峰面积与空白组织匀浆液处理后加相应对照品进样所得峰面积相比，计算回收率。质控样品进样后所得峰面积为分子，对应浓度的对照品溶液直接进样后所得峰面积为分母进行计算，计算基质效应。样品保存24 h后，以RSD%评价样品测定的稳定性。

2.5 数据处理

使用DAS3.0软件计算XLP功效成分在各时间段的药时曲线下面积（Area under the curve，AUC）。通过成分在单一组织AUC值与全部组织总AUC值的比值计算分布百分比（Distribution percentage，DP）。SPSS20.0软件中ANOVA分析各成分在不同组织间的分布差异（P<0.05具有统计学意义）。

3 试验结果

3.1 方法学考察

专属性试验表明空白组织匀浆夜对各成分出峰时间干扰小，分析物在样品出峰时间合适，峰型良好，分离度恰当（图1）。各分析物在相应范围内线性关系良好（R>0.99），且定量下限满足样品含量检测要求（表2）。各成分在低、中、高3种浓度水平质控样品精密度RSD小于11.0%，准确度RE范围为-5.7%-11.6%，说明方法检测准确可靠。回收率范围为89.8%-102.1%，基质效应范围为91.2%-101.6%，提示方法准确度良好，且检测过程不受离子效应干扰。稳定性试验结果表明RSD（<6%）符合实验要求。经验证，该方法符合小鼠组织匀浆液中8种XLP功效成分的检测要求，可用于小鼠组织分布研究（表3）。

表2 香连丸功效成分在组织匀浆液中的线性关系考察。

表3 香连丸功效成分在组织匀浆液中精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性考察（n=6）

图1 香连丸组织匀浆液的UPLC-MS/MS专属性考察。

3.2 组织分布研究

小鼠口服XLP后，其主要功效成分广泛分布于体内组织，其中黄连生物碱类成分是方药中高浓度成分，在各组织中具有较高的AUC值（图2、表4）。XLP成分在小肠组织具有较高浓度，DP值>25%。小檗碱、黄连碱、巴马汀和药根碱在小肠的DP值分别为48.5%、30.3%、28.3%和29.3%，显著高于其他组织。其次小檗碱在肝组织，黄连碱在心组织，巴马汀和药根碱在肾组织具有较高分布。木香烃内酯和去氢木香内酯在肺和小肠组织具有高浓度，其在肺部DP值分别高达40.6%和47.5%，在小肠的DP值分别为28.1%和25.6%。吴茱萸碱和吴茱萸次碱在结肠和小肠具有较高浓度，其在结肠的DP值分别为32.7%和27.5%，在小肠为26.8%和27.9%（表5）。

表4 小鼠口服香连丸后8种主要功效成分在各组织中的AUC0 h-8 h（n=6，h·μg·g-1）

表5 小鼠口服香连丸后8种主要功效成分在各组织中的分布百分比（n=6，%）

图2 小鼠口服香连丸后8种功效成分的组织分布特征（n=6）。

4 讨论

4.1 XLP功效成分的组织分布特征分析

研究结果表明，小鼠口服XLP后其主要功效成分广泛分布于体内组织，4种黄连生物碱成分的组织浓度最高，其次为2种木香内酯成分，2种吴茱萸内酯含量最低，这种现象主要以方药本身的药味配伍剂量有关。本研究发现XLP功效成分在小肠的DP值大于25%，提示其在小肠组织的浓度较高。纵观全身组织脏器，各类成分的分布特征存在差异，具体主要与其理化性质及肠道吸收特征有关：①君药黄连中小檗碱、黄连碱、巴马汀和药根碱在小肠的DP值分别为48.5%、30.3%、28.3%和29.3%，表明黄连生物碱类成分难以吸收入血，主要滞留于小肠组织。前期研究证实这4种黄连生物碱具有相同的母核结构，属于异喹啉类生物碱，极性较大，肠道跨膜转运能力较差，吸收进入肠细胞后还存在P-糖蛋白介导的外排现象，这些低吸收特征限制了XLP中生物碱类成分肠道吸收入血[5-6]；②臣药木香中木香烃内酯和去氢木香内酯，除了在肠道组织具有高浓度外，其在肺部组织的DP值分别高达40.6%和47.5%，提示该类成分易于吸收入血而高比例分布于肺组织。木香成分内酯结构极性较小，生物膜透过性良好，主要以被动扩散的形式被肠道吸收，因此这类成分吸收入血后在肺部组织具有高分布，与前期报道一致[7]；③吴茱萸碱和吴茱萸次碱属于佐使药吴茱萸的主要成分，两者同时高分布于肠道组织，可能与其水溶性差有关[8]，从而低浓度分布于其他脏器组织。吴茱萸碱和吴茱萸次碱在结肠的分布与小肠相当，提示两者在肠道吸收窗口无选择性，前期报道两者在小肠和结肠具有类似的吸收速率常数和有效渗透系数[9]，本研究与前期报道相符。

此外，XLP中巴马汀在肾脏组织浓度与小肠组织相当，木香烃内酯和去氢木香内酯在肺部组织显著高于小肠组织，以上现象排除了肠组织样品处理操作不当，药物粘附肠壁的可能。尽管小肠部位肠绒毛丰富，皱褶较多，是药物吸收的主要部位，但并不代表药物高分布于肠组织，以上分析提示XLP功效成分组织分布特征是其理化性质与机体综合作用的结果。

4.2 XLP功效成分组织分布与其药效的相关性分析

肠道炎症和痉挛性腹痛是溃疡性结肠炎主要临床症状，XLP中黄连清热燥湿，泻火解毒，吴茱萸炮制能引药入肝，增加黄连疏肝止痛之功，木香行气止痛，全方对溃疡性结肠炎的临床症状具有良好的改善作用，其功效成分组织分布特征有助于解释其良好的临床治疗效果。董艳[10-11]发现，XLP给药可以通过调节IL-6/STAT3通路抑制溃疡性结肠炎模型大鼠的肠黏膜STAT3活化，促进炎症细胞的凋亡；提高Bcl-2 mRNA水平，降低Bax mRNA表达，改善结肠黏膜损伤，减少上皮细胞凋亡，多途径缓解肠道炎症，这些作用途径与黄连生物碱抗炎和免疫调节药理活性相一致[12-13]。相比于其他功效成分，黄连生物碱是XLP口服后在肠道组织高浓度长时间滞留的组分，推测这类成分是XLP发挥抗炎作用的主要成分（表4）。除抗炎作用之外，黄连生物碱可以抑制肠上皮细胞屏障功能障碍，对肠道黏膜损伤具有良好的预防和修复作用[14-15]，进一步佐证其多成分多靶点药理作用。

木香中内酯类成分木香烃内酯和去氢木香内酯在肠道组织具有较高浓度，这2种成分是木香改善胃肠道痉挛作用的主要成分，其发挥药理作用的机理涉及到抑制毒蕈碱受体、血清素受体和钙离子外排等途径，这提示XLP临床改善溃疡性结肠炎患者腹痛症状可能与木香内酯成分肠道高浓度滞留有关[16]。2种木香内酯成分在肺部组织具有高分布，药理研究表明其可以通过调控MAPK信号通路和/或抑制巨噬细胞的激活等途径减轻肺部炎症损伤[17-19]，对改善肺纤维化同样具有良好的生物活性[20]。木香辛苦而温，能升降诸气，其功效成分在肺部组织的分布推测有利于调整肺部生理功能。XLP中木香作为臣药配伍使用发挥行气化滞止痛之功，然而这种临床效应机制是否与肺部功能的调整作用有关，仍需进一步的探讨。

吴茱萸碱和吴茱萸次碱具有抗炎和镇痛作用，可以协同黄连生物碱在肠道抗炎，还能通过抑制疼痛介质释放、过氧化损伤及一氧化氮损伤，协同木香内酯发挥镇痛作用[21]，在方药中发挥佐使药的功效，整体加强方药改善溃疡性结肠炎的炎症和腹痛的作用。此外，本文推测XLP体内组织分布特征可能是全方配伍成分相互作用的结果。前期发现吴茱萸配伍可增加黄连生物碱的肝脏分布，降低其在肺部比例[22]，研究还发现了类似的现象，肝DP值>16%，肺部DP值<10%，这有利于解释XLP中黄连萸制发挥引药入肝，增加疏肝散寒止痛的作用，然而这种分布趋势与方药配伍的联系，有待于进一步系统研究。