UPLC指纹图谱结合多元统计分析的吴茱萸与制吴茱萸成分变化研究

杨文惠，吕渭升，孙冬梅，罗文汇，杨 洁，何民友，潘礼业，李振雨*

1广东一方制药有限公司；2广东省中药配方颗粒企业重点实验室，佛山 528244；3江西一方天江药业有限公司，南昌 330000

吴茱萸，始载于《神农本草经》，被列为中品。吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实[1]。8～11月果实尚未开裂时，剪下果枝，晒干或低温干燥，除去枝、叶、果梗等杂质[1]。吴茱萸具有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻的作用，临床用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，经行腹痛，脘腹胀痛，呕吐吞酸，五更泄泻[1]。现代研究表明，吴茱萸具有舒张血管、抗炎、镇痛、抗菌、中枢保护、止吐止呕等多种药理作用[2-5]。吴茱萸与其甘草汁炮制品(以下简称“制吴茱萸”)的药理作用有所不同，其原因可能与吴茱萸炮制前后化学成分的变化有关。吴茱萸经甘草汁炮制后，能降低吴茱萸毒性，缓和燥性[6]。

吴茱萸中的化学成分众多，药理活性复杂。其主要的化学成分包括生物碱、苦味素、黄酮和挥发油等[7]。由于中药中化学成分的多样性及复杂性，单一成分定量的化学成分质量控制模式不仅缺乏专属性，而且难以反映中药的内在质量属性。因此，需要准确阐述吴茱萸及制吴茱萸中各类成分的变化，总结炮制前后药效成分变化的规律，才能更全面地解释其药理活性与临床作用的不同。近年来，新仪器、新技术的大量涌现，使得指纹图谱以及化学模式识别成为中药材质量研究的主流，指纹图谱结合化学计量学分析方法对中药的整体质量控制提供了一种新的思路[8,9]。

本研究采用超高效液相色谱(UPLC)技术，建立吴茱萸及制吴茱萸指纹图谱，结合相似度评价和多元统计分析方法聚类分析(CA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)进行综合评价，从多角度分析吴茱萸炮制前后的差异性成分，初步探讨了吴茱萸与制吴茱萸药理作用与化学成分的相关性，一定程度上阐释了吴茱萸炮制前后药理作用改变与化学成分变化之间的联系，可以为吴茱萸的质量及炮制研究提供数据参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

超高效液相色谱仪(Waters H-Class，沃特世公司)；YMC Triart C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；万分之一分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百万分之一分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；百分之一天平(JJ600，常熟市双杰测试仪器厂)；数控超声波清洗器(KQ500D，昆山市超声仪器有限公司)；超纯水系统(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

1.2 材料

试剂：乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(天津市富宇精细化工有限公司，色谱纯)；乙腈(默克股份有限公司，色谱纯)；水为超纯水(实验室自制)。

试药：柠檬苦素(四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq16030802，含量98%)；吴茱萸碱(中国食品药品检定研究院，批号：110802-201710，含量99.6%)；吴茱萸次碱(中国食品药品检定研究院，批号：110801-201608，含量99.7%)；去氢吴茱萸碱(上海同田生物技术有限公司，批号：17052721，含量98%)；金丝桃苷(中国食品药品检定研究院，批号：111521-201809，含量94.90%)；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-202018，含量96.10%)；新绿原酸(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq19021413，含量99.90%)；隐绿原酸(成都普菲德生物技术有限公司，批号：15121701，含量98%)；咖啡酸(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，含量99.70%)。

14批吴茱萸药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定均为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果实，经检验，均符合2020年版《中国药典》吴茱萸药材项下的规定，药材来源信息见表1(其中以S代表吴茱萸，ZS代表制吴茱萸)。

表1 14批吴茱萸来源信息表

2 方法与结果

2.1 制吴茱萸饮片的炮制

取吴茱萸药材，除去枝、叶、果梗等杂质，即得吴茱萸饮片。参照2020版《中国药典》“制吴茱萸”项下方法进行炮制[1]：取6 g甘草捣碎，加适量水，煎汤，去渣，加入100 g吴茱萸饮片(即净吴茱萸)，闷润吸尽后，炒至微干，取出，干燥，即得14批制吴茱萸饮片(编号ZS1～ZS14，详见表1)。

2.2 指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱：YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～9 min，8%A；9～18 min，8%→30%A；18～28 min，30%→80%A；28～33 min，80%→100%A)；流速为0.30 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；进样量为1 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

取甘草酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL含50 μg甘草酸对照品溶液；取去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL含去氢吴茱萸碱50 μg、吴茱萸碱50 μg、吴茱萸次碱20 μg的混合对照品溶液Ⅰ；取金丝桃苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL各含金丝桃苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸30 μg的混合对照品溶液Ⅱ。

2.2.3 供试品溶液的制备

取吴茱萸或制吴茱萸样品粉末(过三号筛)各约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)40 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.4 指纹图谱方法学考察

2.2.4.1 精密度试验

取“2.2.3”项下吴茱萸供试品溶液(编号S5)，按“2.2.1”项下确定的色谱条件连续进样6次，测定指纹图谱，以去氢吴茱萸碱峰为参照峰S，计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值。结果显示，各共有峰与S峰的相对保留时间RSD值均小于0.16%；相对峰面积RSD值均小于0.88%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 重复性试验

取同一批次的吴茱萸药材粉末(编号S5)，按“2.2.3”项下确定的供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，分别进样测定，以去氢吴茱萸碱峰为参照峰S，计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值。结果显示，各共有峰与S峰的相对保留时间RSD值均小于0.48%；相对峰面积RSD值均小于1.51%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.3 稳定性试验

取“2.2.3”项下吴茱萸供试品溶液(编号S5)，按“2.2.1”项下确定的色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，以去氢吴茱萸碱峰为参照峰S，计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值。结果显示，各共有峰与S峰的相对保留时间RSD值均小于0.47%；相对峰面积RSD值均小于1.74%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 吴茱萸及制吴茱萸指纹图谱的建立

取14批吴茱萸和制吴茱萸样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录各样品指纹图谱的色谱图。导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，以编号为S1样品的指纹图谱为参照图谱，进行全峰匹配，14批吴茱萸及制吴茱萸指纹图谱叠加图见图1、图2，以平均数法生成吴茱萸及制吴茱萸对照指纹图谱(见图3)。去氢吴茱萸碱为吴茱萸的主要有效成分之一，色谱峰位置居中，且响应较高，与相邻的色谱峰分离效果较好，因此选择去氢吴茱萸碱色谱峰为参照峰S，在吴茱萸指纹图谱中标识出27个共有指纹峰，制吴茱萸指纹图谱标识出28个共有峰，在保留时间23 min左右，制吴茱萸比吴茱萸多了28号色谱峰，如图3所示。经与对照品比对，28号色谱峰确定为甘草酸，为制吴茱萸炮制后产生。

图1 14批吴茱萸指纹图谱叠加图

图2 14批制吴茱萸指纹图谱叠加图

图3 吴茱萸(R1)和制吴茱萸(R2)指纹图谱共有模式图

2.2.6 吴茱萸及制吴茱萸指纹图谱色谱峰的指认

取混合对照品溶液Ⅰ、Ⅱ及吴茱萸、制吴茱萸供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果见图4。经与对照品保留时间及紫外吸收光谱比对，确定峰4为新绿原酸；峰9为绿原酸；峰10为隐绿原酸；峰11为咖啡酸；峰13为金丝桃苷；峰16为去氢吴茱萸碱；峰21为吴茱萸碱；峰22为吴茱萸次碱；峰28为甘草酸。

图4 吴茱萸及制吴茱萸指纹图谱色谱峰指认

2.2.7 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算14批吴茱萸及制吴茱萸指纹图谱的相似度(见表2、表3)，结果显示，14批吴茱萸的相似度在0.680～0.963范围内；14批制吴茱萸的相似度在0.724～0.962范围内，来自江西产区(编号S1、S2、S3、S9、ZS1、ZS2、ZS3、ZS9)的吴茱萸及制吴茱萸的相似度较低；来自湖南、广西产区(编号S4～S8、S10、S11、S12、S14、ZS4～ZS8、ZS10、ZS11、ZS12、ZS14)的吴茱萸及制吴茱萸的相似度较高；说明江西产区的吴茱萸及制吴茱萸质量与广西、湖南两个产区的吴茱萸及制吴茱萸质量存在一定差异。广西、湖南两个产区的吴茱萸及制吴茱萸虽然也存在一定的差异，但与江西产区相比，差异较小。另外1批湖南产区(编号S13和ZS13)的吴茱萸和制吴茱萸相似度也较低，可能与药材的采收时间、产地加工方式的差异有关。

表2 14批吴茱萸指纹图谱相似度评价表

表3 14批制吴茱萸指纹图谱相似度评价表

2.2.8 吴茱萸和制吴茱萸UPLC指纹图谱的OPLS-DA分析

正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，其最大特点是能够去除自变量X中与分类变量Y无关的数据变异，使分类信息主要集中在一个主成分中，从而让模型变得简单和易于解释，其判别效果及主成分得分图的可视化效果更加明显。采用正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)可以进行有监督的模式识别，显示样本间差异主要由哪些变量引起，寻找差异性标志物[9]，已广泛应用于中药材产地、基原、炮制、真伪鉴别等方面[10]。

本研究运用IBM SPSS Statistics 20.0 统计软件以27个共有峰及制吴茱萸新增的28号峰峰面积为变量对吴茱萸和制吴茱萸进行OPLS-DA分析，通过OPLS-DA的Scores图(见图5)可知，吴茱萸和制吴茱萸明显分为2类；所建立的模型中累积解释能力参数R2X(cum)为0.995，累积解释能力参数R2Y(cum)为0.996，预测能力参数Q2(cum)为0.967，这三个参数值均接近于1，表明该模型的拟合准确性好，具有较强的解释和预测能力；运用统计软件修改假设检验的次数为200次，结果见OPLS-DA的Permutation图(见图6)。由图6可知，R2和Q2截距值分别为0.488和-1.61，所有R2和Q2的左边的点都低于最右边的点，说明建立的OPLS-DA模型没有出现过拟合现象，可以用于吴茱萸及制吴茱萸的模式识别。通过OPLS-DA的S-plot图(见图7)结合VIP图(见图8)可知，以VIP大于1为显著影响，共找到6个差异标志物，对其影响显著性排序，分别为甘草酸>吴茱萸碱>峰3>峰1>绿原酸>峰2，提示这几个化学成分对于区分吴茱萸和制吴茱萸的贡献较大，表明这6个化学成分为吴茱萸与制吴茱萸的差异性成分。

图5 OPLS-DA分析的Score图

图6 OPLS-DA分析的Permutation图

图7 OPLS-DA分析S-plot图

图8 OPLS-DA分析VIP图

2.2.9 统计学分析

以平均峰面积为变量，对14批吴茱萸和制吴茱萸6个差异成分色谱峰的平均峰面积进行配对t检验，绘制出t检验图(见图9)，P<0.05，表示差异具有统计学意义，结果显示，吴茱萸炮制后，峰21(吴茱萸碱)平均峰面积明显降低，P<0.05，峰28(甘草酸)为新增成分，其余5个差异性化学成分的平均峰面积均有不同程度的降低，但无明显统计学意义。

图9 6个差异性成分平均峰面积t检验图

3 讨论与结论

吴茱萸指纹图谱的建立，一方面可以对不同产区的吴茱萸质量进行初步的评价，另一方面也能够明显区分出吴茱萸与制吴茱萸，吴茱萸指纹图谱共标识出27个共有色谱峰，制吴茱萸新增共有色谱峰28，为甘草酸，由制吴茱萸炮制后产生，利用此峰可以明显区分吴茱萸生品和炮制品。相似度评价结果显示，除4批江西产区的样品外，其余产地吴茱萸指纹图谱相似度较高。其中湖南产区出现1批相似度异常，可能与采收时间、产地加工方式的不同有关。通过正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)找到6个差异标志物，对其影响显著性排序，分别为甘草酸>吴茱萸碱>峰3>峰1>绿原酸>峰2。

中医理论认为，中药吴茱萸性热苦寒，有散热止痛、降逆止呕之功，用于治疗肝胃虚寒、阴浊上逆所致的头痛或胃脘疼痛等症。而甘草性平，味甘，具有补脾益气，缓急止痛，调和诸药的作用。因此，吴茱萸经甘草汁炙后，一定程度能降低毒性、缓和燥性，适用于脾胃虚弱者。吴茱萸经甘草汁炮制后除增加甘草酸外，其余5个差异标志物，平均峰面积均呈下降趋势，有报道指出吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素对人胚肾细胞有一定的毒性作用[11]，因此，吴茱萸炮制后吴茱萸碱等化学成分含量的降低，是制吴茱萸炮制后毒性降低的原因之一。也有研究表明，吴茱萸不同组分均具有毒性，强度为挥发油>全组分>醇提组分>水提组分[12]，因此，制吴茱萸在炮制过程中，由于受热，挥发油含量降低，使得其毒性减弱，同时，绿原酸等酚酸类成分因热不稳定，含量降低，也使吴茱萸药效更加缓和。

本研究采用超高效液相色谱(UPLC)法建立吴茱萸与制吴茱萸指纹图谱，该方法专属性强，重复性好，初步探讨了吴茱萸与制吴茱萸药理作用与化学成分的相关性，一定程度上阐释了吴茱萸炮制前后药理作用改变与化学成分变化之间的联系，可以为吴茱萸的质量及炮制研究提供数据参考。