谷胱甘肽对克氏原螯虾生长和抗高温应激的影响

冯具攀，魏开金，徐 进，于瑶瑶，徐 滨，马宝珊，朱祥云

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室，武汉 430223)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称小龙虾，是我国目前养殖规模最大的淡水养殖虾类，2019年养殖面积超过128万hm2，总产量达208.96万t，经济总产值4 110亿元[1]。在养殖和运输过程中，克氏原螯虾会面临着各种不同形式的应激因子，如水温、盐度、溶氧、氨氮、pH值、亚硝酸盐以及水体污染等[2]。其中以高温应激最常见、危害最大。克氏原螯虾的最适生长温度为21～28 ℃[3]，前期研究结果显示，水温超过30 ℃即可引起克氏原螯虾机体产生应激反应，造成克氏原螯虾生理机能紊乱[4]，导致其免疫力和抗病力显著下降[5]。如何避免或缓解高温应激造成的不良影响，提高克氏原螯虾的抗应激能力，是目前亟需解决的问题。

谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine，glutathione，GSH)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物，是一种天然的抗氧化剂，能增强动物的免疫和抗氧化能力[6]。谷胱甘肽在自然界中以还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)两种形式存在，主要活性成分是还原型谷胱甘肽，因此，通常所说的谷胱甘肽主要指的是还原型谷胱甘肽[7]。GSH在细胞内是谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶的特有底物，能促进二者的合成而清除过氧化物和氧自由基，以维持细胞的正常生理功能[8]。GSH能否提高克氏原螯虾的抗高温应激能力尚未可知。本实验旨在评价GSH对克氏原螯虾抗高温应激能力和生长的影响，为产业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

克氏原螯虾来自长江水产研究所梁子湖实验基地。实验选择健康、活力高、规格基本一致，初体重为(7.74±0.5) g的克氏原螯虾。还原型谷胱甘肽购于上海源叶生物科技有限公司，含量99%。

1.2 养殖实验

养殖实验分6个组，其中5个添加组和一个空白对照组，每组设3个平行组，每个平行组克氏原螯虾30尾。空白对照组投喂市售常规商品饲料(不含GSH)，添加组在商品饲料中分别添加0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 g/kg GSH。实验虾暂养1周后开始养殖实验，以虾体重的5.0%投喂。每天在8:00～8:30、19:00～19:30各投喂1次，当地河水流水养殖，养殖期间24 h持续增氧，及时清污。养殖实验开始前和结束后，对每组实验虾进行称重，计算平均体重增重率和饲料系数。

体重增重率=(实验末虾体质量-实验前虾体质量)/实验前虾体质量×100%

饲料系数=饲料消耗量/增重量

1.3 应激实验及样本采集和测定

饲养6周后，开始高温应激实验。将各组实验虾分别放入35 ℃水温的实验盆中连续应激48 h。应激实验期间持续增氧，并减少人为干扰。在应激前(0 h)及应激后6、12、24、48 h，每个平行组随机取3尾虾采集血淋巴液，每个浓度组9个样本。将虾迅速捞起并立即用1 mL注射器在围心腔采取血淋巴，采用等体积的肝素钠溶液(0.02 g/mL)抗凝。血淋巴液在4 ℃、10 000 r/min离心10 min后取上清液于-80 ℃保存待用。谷胱甘肽转移酶(GSH-T)、总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)，采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.4 数据分析

数据用SPSS 20.0软件单因素方差分析(one way ANOVA)和DUNCAN多重比较[9]，所有结果均以平均值±标准差来表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 谷胱甘肽对克氏原螯虾血淋巴抗氧化指标的影响

谷胱甘肽转移酶的检测结果显示(表1)，应激前各实验组实验虾血淋巴中GSH-T含量无显著差异。0.30 g/kg浓度组在应激6 h后血淋巴中的GSH-T含量比对照组显著增加，0.24 g/kg浓度组在应激12 h后血淋巴中的GSH-T含量比对照组显著增加，而低于此添加浓度，GSH对GSH-T的影响不明显。添加组血淋巴中GSH-T含量在应激后至24 h呈现出增加的趋势，并在24 h大幅提升到最大值，随后降低，趋于稳定。

表1 谷胱甘肽对克氏原螯虾血淋巴中GSH-T的影响

总抗氧化能力的检测结果显示(表2)，应激前各实验组实验虾血淋巴中T-AOC水平无显著性差异。0.30 g/kg浓度组在应激6 h后血淋巴中的T-AOC含量比对照组显著增加，0.24 g/kg浓度组在应激12 h后血淋巴中的T-AOC含量比对照组显著增加，而低于此添加浓度，GSH对T-AOC的影响不明显。添加组血淋巴中T-AOC含量在应激后总体上呈现先升高再下降的趋势，应激后12 h达到最高值。

表2 谷胱甘肽对克氏原螯虾血淋巴中总抗氧化能力的影响

总超氧化物歧化酶的检测结果显示(表3)，应激前各实验组实验虾血淋巴中的T-SOD水平无显著性差异。与对照组相比，0.24 g/kg和0.30 g/kg浓度组在应激后6 h，T-SOD水平显著升高；0.18 g/kg浓度组在应激后24 h，T-SOD水平显著升高；而0.06 g/kg和0.12 g/kg添加组在应激后血淋巴中的T-SOD水平与对照组无显著性差异。添加组血淋巴中T-SOD水平在应激后总体上呈现先升高再下降的趋势，应激后6 h达到峰值，12 h后降至低于应激前水平。

表3 谷胱甘肽对克氏原螯虾血淋巴中总超氧化物歧化酶的影响

过氧化氢酶的测定结果显示(表4)，应激前各实验组虾血淋巴中的CAT含量无显著性差异。与对照组相比，0.24 g/kg和0.30 g/kg浓度组在应激后6 h，CAT水平显著升高；而低于0.24 g/kg的添加组应激后血淋巴中的CAT水平与对照组无显著性差异。各实验组血淋巴中CAT水平在应激后总体上呈现先升高再下降的趋势，应激后12 h达到峰值，随后回落至应激前水平。

表4 谷胱甘肽对克氏原螯虾血淋巴中过氧化氢酶的影响

丙二醛的测定结果显示(表5)，应激前各实验组虾血淋巴中的MDA含量无显著性差异。各实验组虾血淋巴中MDA含量在应激后呈现出先升高后降低的趋势，在应激后12 h达到最大值，而后逐渐降低，趋于稳定。0.24 g/kg和0.30 g/kg浓度组MDA含量在应激后12 h均比对照组显著降低，0.12 g/kg和0.18 g/kg浓度组MDA含量在应激后24 h均比对照组显著降低，48 h后差异不显著。

表5 谷胱甘肽对克氏原螯虾血淋巴中丙二醛的影响

2.2 谷胱甘肽对克氏原螯虾生长的影响

养殖实验结束后对各组实验虾的体重进行测定。结果显示(表6)，除了0.06 g/kg添加组的实验虾的增重率与对照组无显著性差异外，其它添加组均比对照组有显著性提升；0.18、0.24、0.30 g/kg添加组的饲料系数比对照组显著降低。其中0.30 g/kg添加组的增重率最高，饲料系数最低。

表6 谷胱甘肽对克氏原螯虾生长的影响

3 讨论

3.1 谷胱甘肽对克氏原螯虾抗氧化能力的影响

动物应激会产生超量的活性氧自由基，从而引发机体内部的新陈代谢失调，使动物的健康和营养状态受到很大影响。动物体内存在着抗氧化物酶，如谷胱甘肽巯基转移酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等，可以清除机体内多余的自由基，并且这些抗氧化酶活性的提高也有助于缓解多不饱和脂肪酸氧化、亚硝酸盐应激、饥饿、温度变化产生的氧化应激[10]。本实验投喂谷胱甘肽能显著提高克氏原螯虾血淋巴中各抗氧化酶的水平，表明机体的抗氧化能力得到增强。MDA是膜脂过氧化的最重要产物之一，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，因而具有很强的细胞毒性，会对机体造成损害[11,12]。因此，检测MDA的含量能了解膜脂的过氧化程度，评估氧化应激的危害程度。本实验中投喂谷胱甘肽能显著降低克氏原螯虾在高温应激时血淋巴中的MDA含量，表明谷胱甘肽能有效提高机体的抗应激能力，降低高温应激造成的氧化损伤。本实验结果与其它水产动物的研究结果一致。研究资料显示，饲料中添加适量谷胱甘肽可显著提高草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏谷胱甘肽水平、谷胱甘肽过氧化物酶活力和超氧化物歧化酶活力，显著增强草鱼的抗氧化能力、非特异性免疫力以及生长性能[13-16]。在吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)上的研究显示，饲料添加0.24g/kg谷胱甘肽可显著提高吉富罗非鱼肝脏谷胱甘肽转移酶活力、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力和过氧化氢酶活力，并且显著降低丙二醛含量[17]。谷胱甘肽能显著提高凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[18]、皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)[19]肝胰腺中抗氧化酶活力以及总抗氧化能力。

3.2 谷胱甘肽对克氏原螯虾生长的影响

已有许多研究表明，谷胱甘肽对水产动物生长具有促进作用。周艳玲[20]研究发现，随着日粮中谷胱甘肽添加量的增加，黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)的增重率会呈现出先升高后下降的趋势，生长指标在添加量为0.30 g/kg时达到最大值，且添加组均显著高于对照组。饲料中添加适量谷胱甘肽可使草鱼的特定生长率和存活率显著提高并且降低饲料系数，添加量为300 mg/kg时特定生长率最高,比对照组提高10.08%[15]。刘晓华等[21]研究表明，在凡纳滨对虾基础日粮中添加适量谷胱甘肽，能够显著提高其增重率和饲料转化效率，并且各添加组的成活率均显著高于对照组。当饲料中谷胱甘肽添加量为0.18 g/kg时增重率达到最大值。本实验也证实了添加量大于0.18 g/kg的谷胱甘肽能显著提高克氏原螯虾的增长率，降低饵料系数。对于谷胱甘肽的促生长机制，已有研究表明，谷胱甘肽能上调类胰岛素生长因子Ⅰ和生长激素基因的表达,增加生长激素、甲状腺激素和类胰岛素生长因子I的分泌，促进罗非鱼的生长[17,22,23]。除了促进生长激素的分泌，我们推测谷胱甘肽的促生长作用也跟其抗应激作用相关。前期研究结果显示，克氏原螯虾在高温应激时，机体会大量消耗葡萄糖、蛋白质和脂肪来应对和消除应激的不良影响[3]，而谷胱甘肽能有效降低机体的应激反应，减少了上述营养物质的消耗，间接促进了营养物质的积累和体重的增加。谷胱甘肽的促生长机制，还需从物质能量代谢的角度做进一步研究和探讨。