不同种属芽孢杆菌对彭泽鲫生长性能、背肌营养成分、肠道结构及消化酶活的影响

罗 莎， 姜永杰， 赵丽梅， 张海涛， 张旭娟

（广东恒兴饲料实业股份有限公司，广东湛江524000）

随着我国渔业的发展，养殖密度的增长，养殖户在养殖过程中大量投喂人工配合饲料，养殖水体中饲料残饵和排泄废物等大量积累，致使养殖水体日益恶化，鱼病爆发愈发频密。抗生素在水产养殖业的广泛使用，对水生动物疾病防治起到了十分积极的作用。但也造成了一系列严重的问题，特别是耐药性、药残、污染环境、食品安全等问题引发社会各界的高度关注（Balcázar等，2006；Gatesoupe等1999）。由此，减少抗生素的使用，研发其替代品成为国内外学者的研究热点（Rosalie等2001；Bruno等，2000）。益生菌是一类对宿主有益的微生物，被作为一种新型的饲料添加剂，其能增强营养物质在肠道内的消化吸收，调节宿主肠道内的微生态平衡，同时提高机体免疫与抗病能力（Otles等，2003）。水产上主要使用的益生菌菌种有芽孢杆菌属、乳酸菌属、弧菌属和酵母等。其中芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱等生物学优点，满足饲料加工特性，特别是可耐受膨化质粒中调制的高温高压。2018年我国农业部公布的《饲料添加剂品种目录》统计结果表明，可添加于饲料中的芽孢杆菌分别是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌（袁翠林等，2015）。已有研究表明，在水产饲料中添加芽孢杆菌，能够抑制水产动物肠道内有害微生物的快速繁殖生长，促进有益菌群的定植、生长、繁殖，进而维持机体肠道内的菌群平衡，同时可以提高动物的消化酶活性，增强机体免疫功能，达到促进动物生长的目的（孔祎頔等，2019；王振华等，2018；苏艳莉等，2016）。但目前研究菌种主要集中在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，而有关凝结芽孢杆菌在水产动物中的研究应用则较少。因此，本研究以彭泽鲫（Carassius auratus var.Pengze）作为研究对象，在饲料中添加枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）及地衣芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌的混合菌，研究其对彭泽鲫生长、背肌营养成分、肠道结构及消化酶活性的影响，为芽孢杆菌在水产饲料中的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼 试验鱼来自江苏省高邮市卸甲镇养殖户鱼塘，试验开始前暂养于盐城恒兴饲料有限公司试验基地。

1.2 试验饲料 以鱼粉、豆粕、菜籽粕为蛋白原，共制作4种饲料，其中基础饲料组作为对照组；其余4组分别在基础饲料中添加1.5×108cfu/g的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及复合菌（地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌=1：1），菌种由广州市科沐生物技术有限公司生产提供。采用逐级混匀的方式，混合均匀后，制粒成直径2 mm的饲料，晒干后于阴凉干燥处保存，避免氧化。基础饲料组成及营养水平见表1。

表1 基础饲料组成及营养水平（干物质基础） %

1.3 试验设计 试验开始时，停食24 h，选取健壮整齐的初始体质量为（25.04±0.21）g的彭泽鲫500尾，分成5组，每组4个重复，每个重复25尾，以重复为单位放养于试验养殖水族箱中，分别饲喂对应饲料。养殖周期为60 d。

1.4 饲养管理 流水饲养，每天水交换量约为2倍养殖水体积，水源为经过过滤、曝气充氧的地下井水。每天投喂相应饲料两次（8：30、16：00），饱食投喂，投喂前关闭充气泵。每天监测水温、水流和充气，记录摄食量等。整个试验期间水温控制22～25℃，pH 7.6～8.2，溶氧≧5 mg/L，氨氮＜0.05 mg/L。

1.5 样本采集与测定 试验结束前24 h停止投喂，称量每水族箱试验鱼总重。每水族箱随机取15尾鱼，尾静脉采血，至于4℃冰箱12 h待血液凝固分层后，4℃离心机3500 r/min离心10 min，制备血清。取血后，于冰上解剖，分离肝胰脏和肠道用于测定消化酶活性。另取5尾鱼，用生理盐水冲洗肠道内容物，根据肠道回折处，将肠道分为前肠、中肠、后肠三部分，前肠和中肠部分取1～2 cm，用福尔马林固定，放置于4℃冰箱保存，用于制作组织切片。

1.5.1 饲料及肌肉营养成分的测定 水分含量测定采用105℃恒温烘干失重法 （GB 5009.3-2010）；粗蛋白质测定采用凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）；粗脂肪测定采用索氏抽提法（GB 5009.6-2010）；粗灰分测定采用马福炉高温灼烧法（GB 5009.4-2010）。

1.5.2 组织切片制作 常规法脱水，石蜡包埋后用冷冻切片机（Leica rm2245）连续切片，用伊红和苏木精依次染色，树胶封片，在光学显微镜（Olympus ix71）下观察其形态和结构。

1.5.3 组织消化酶活性的测定 用预冷的生理盐水（4℃）清洗肠道，剔除脂肪、肠系膜，用滤纸吸干后，准确称取肠道组织质量，按质量（g）：体积（mL）=1：9的比例，加入组织质量9倍体积的生理盐水，在冰水浴条件下进行机械匀浆，2500 r/min离心10 min，取上清，然后于4℃条件下保存待用。所有消化酶活性均采用南京建成生物工程研究所生产试剂盒进行测定。

1.6 统计分析 试验数据以“平均数±标准误”表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，若方差分析显著，进一步进行Duncan’s比较，差异显著水平设定为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及复合菌对彭泽鲫生长性能的影响不同芽孢杆菌对彭泽鲫生长性能的影响见表2。与对照组相比，饲料中添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及复合菌（地衣：凝结=1：1）后，彭泽鲫的增重率及特定生长率均显著升高（P＜0.05），且饲料系数显著降低（P＜0.05）。其中复合菌组对彭泽鲫促生长、降低饵料系数的表现最为突出，与对照组相比，末重增长18.64%，增重率增长46.79%，特定生长率提高33.72%，饲料系数降低25%。同时饲料中添加各种芽孢杆菌后彭泽鲫形态指标并无显著变化（P＞0.05）。

表2 不同芽孢杆菌对彭泽鲫生长性能的影响

2.2 饲料中添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及复合菌对彭泽鲫背肌营养成分的影响 不同芽孢杆菌对彭泽鲫背肌营养成分的影响见表3。与对照组相比，在饲料中添加不同芽孢杆菌后对彭泽鲫背肌营养组成并无显著影响（P＞0.05）。

表3 不同芽孢杆菌对彭泽鲫背肌营养成分的影响 %

2.3 饲料中添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及复合菌对彭泽鲫肠道结构的影响不同芽孢杆菌对彭泽鲫前肠及中肠肠道结构的影响见表4。饲料中添加芽孢杆菌后，彭泽鲫前肠和中肠肠道截面面积变大，褶皱数增多，肌层厚度加厚，但差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比，饲料中添加地衣芽孢杆菌组彭泽鲫前肠绒毛高度显著增高32.49%、中肠绒毛高度显著增高48.81%（P＜0.05）；添加复合菌（地衣：凝结=1：1）组彭泽鲫前肠绒毛高度显著增高38.18%、中肠绒毛高度显著增高52.74%（P＜0.05）。

表4 不同芽孢杆菌对彭泽鲫肠道结构的影响

2.4 饲料中添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及复合菌对彭泽鲫消化酶活性的影响 不同芽孢杆菌对彭泽鲫淀粉酶、胃蛋白酶及脂肪酶活性的影响见表5。与对照组相比，饲喂彭泽鲫含芽孢杆菌的饲料后，彭泽鲫血清、肝胰脏及肠道各部分的淀粉酶、胃蛋白酶及血清脂肪酶活性均升高。其中枯草芽孢杆菌组肝胰脏淀粉酶活性提高51.58%，血清脂肪酶活性提高41.68%（P＜0.05）；复合菌组血清和肝胰脏淀粉酶活性分别升高52.25%和50.97%（P＜0.05），血清脂肪酶活性升高46.16%（P＜0.05），但肠道各处淀粉酶活性与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。同时，淀粉酶与胃蛋白酶活性在肠道内逐渐升高，后肠各消化酶活性最高。

表5 不同芽孢杆菌对彭泽鲫消化酶活性的影响

3 讨论

3.1 不同芽孢杆菌对彭泽鲫生长性能的影响芽孢杆菌具有分泌胞外酶的功能，在动物摄食时，芽孢杆菌随着饲料颗粒进入动物消化道后，会代谢产生大量抑制细菌繁殖生长同时对宿主动物无害的产物，如溶菌酶、超氧化物歧化酶等，除此之外，还能代谢产生各种有益的营养物质，如维生素、氨基酸、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及多种非淀粉多糖酶等（孔祎頔等，2019；王振华等，2018）。

在水产上，已有研究表明，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对动物生长性能有促进作用。饲料中添加2 g/kg枯草芽孢杆菌，黑鲷的增重率显著提高28.86%，特定生长率显著提高16.48%，胃、肠及肝脏的各种消化酶活力均有提高（李盈锋等，2014）。在饲料中添加2×107cfu/g和2×108cfu/g枯草芽孢杆菌，可显著提高团头鲂的增重率及特定生长率，从而提高团头鲂的生长性能（孙盛明等，2016），同时能显著提高青鱼的末体重并降低饲料系数（沈斌乾等，2013）。0.5%和1%的地衣芽孢杆菌可使鲤鱼增重率提高14.35%和15.24%，同时使饵料系数降低73.2%和74.54%（刘阳，2012）。饲料中添加0%～0.6%的地衣芽孢杆菌，（17.47±0.19）g的尖吻鲈的增重率和特定生长率有逐渐升高的趋势，且添加量为0.5%时增重率和特定生长率均达到最大，比对照组分别提高9.77%和4.56%（李卓佳等，2011）。刘波等（2005）的研究结果也显示，地衣芽孢杆菌能增加异育银鲫的消化酶活性，促进鱼体生长，提高饲料利用率，降低饲料系数。本试验与前人研究结果一致，在饲料中添加1.5×108cfu/g的枯草芽孢杆菌可以促进彭泽鲫的生长，降低饲料系数。

凝结芽孢杆菌是一种具有芽孢杆菌能产生孢子且稳定存在，又具有乳酸菌可产生乳酸特性的革兰氏阳性菌（郭庆丰等，2018；张高娜等，2013）。在水产上有研究表明，在饲料中添加凝结芽孢杆菌能促进动物的生长，提高营养物质的利用（王振华等，2018）。付天玺等（2008）和袁丰华等（2010）分别发现，饲料中添加凝结芽孢杆菌后，能显著提高奥尼罗非鱼和尖吻鲈的生长速度，降低饲料系数，提高饲料中营养物质的利用率。饲料中凝结芽孢杆菌活菌含量为3.0×1011cfu/g时，奥尼罗非鱼增重量提高8.56%，饲料系数降低8.18%（许国焕等，2008）。

本试验结果表明，在基础饲料中添加芽孢杆菌对彭泽鲫生长均有促进作用，其中地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌及其复合菌的促生长作用更为显著。这可能与菌种特异性有关，不同的菌种生理生化特性、代谢产物有一定的差异，这将导致在生长过程中分泌代谢物不同，引起的作用效果不同，且同种菌的不同菌株其生理特性也存在一定的差异，导致作用效果也不一定相同（张日俊，2005）。

3.2 不同芽孢杆菌对彭泽鲫背肌营养成分的影响 目前关于在饲料中添加芽孢杆菌对水产动物体营养成分影响的研究得到的结论并不一致。在本试验中，彭泽鲫背肌营养成分与饲料中是否添加芽孢杆菌无显著关系。与沈斌乾等（2013）对青鱼的研究结果相似，青鱼的全鱼营养组成不受饲料中添加的枯草芽孢杆菌影响。同时与Merrifield等（2010）的研究结果，在摄食含枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合菌的饲料10周后，虹鳟的体成分与对照组相比无变化的结果相一致。但王彦波（2010）的研究表明，饲喂罗非鱼含5×106～5×107cfu/g凝结芽孢杆菌的饲料8周后，其肌肉中粗脂肪水平显著低于不添加组。虹鳟鱼苗摄食含1.8×106～6.1×109cfu/g芽孢杆菌的饲料2个月后体脂肪随饲料中芽孢杆菌添加量的上升而不断下降，体蛋白和水分含量也受到一定程度的影响 （Bagheri等，2008）。这可能是因为养殖对象品种不同或试验期所处的生长阶段不同，饲料中添加的芽孢杆菌菌株和剂量不同，会造成芽孢杆菌对鱼体成分影响的程度存在不同结果。

3.3 不同芽孢杆菌对彭泽鲫肠道结构的影响肠道的形态结构和基本功能正常是营养物质被消化吸收的先决条件。已有研究表明芽孢杆菌有助于动物肠道壁增厚、促进肠黏膜生长等，但在鱼类上鲜少报道。鲤鱼摄食含芽孢杆菌的微生物添加剂后，前肠皱褶增多、呈乙形，且隐窝加深，肠上皮的微绒毛变粗、长度更长、数量增多，肠道上可与营养物质接触的面积增大（张锦华，2003；刘克琳等，2000）。本研究结果与前人研究结果类似，饲料中地衣芽孢杆菌和混合菌可显著提高彭泽鲫前肠和中肠的绒毛高度，而单独添加凝结芽孢杆菌，彭泽鲫肠道绒毛高度变化不显著可能是由于本试验中芽孢杆菌添加计量限定，可在今后的试验中探究不同浓度芽孢杆菌对鱼类肠道结构的影响。

3.4 不同芽孢杆菌对彭泽鲫肌消化酶活性的影响 体内消化酶活性的水平直接影响到鱼类对饲料的消化效率，对营养物质的吸收利用程度，从而影响鱼体的健康状况和生长速度。鱼类的消化酶主要有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等。本研究中彭泽鲫后肠淀粉酶和胃蛋白酶活性最高。在鲤鱼上也有类似的研究结果，鲤鱼的蛋白酶在消化道的后肠（后1/3段）活性最高;淀粉酶在整个消化道中均匀分泌，且其活性由前肠向后肠逐渐升高（白东清等，1999；倪寿文等，1992）；但倪寿文等（1993）亦有报道表明鲤鱼消化道后1/3段蛋白酶活性最低。

芽孢杆菌能耐肠道的酸碱环境，芽孢进入肠道后，除了能平衡肠道菌群外，还能产生多种营养物质，如蛋白质或多肽、维生素、氨基酸等（Gatesoupe，1999），还能产生较强的蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、纤维素酶等（Ghosh等，2002），而且这其中的许多酶是动物体本身不能产生的，如植酸酶、果胶酶等。这些酶进入动物体消化道的“酶池”后，提高了消化酶活性，补充机体内源酶的不足，促进肠道黏膜皱襞增多，绒毛增长密集，提高肠黏膜上皮细胞的吸收功能；同时还能维持并调节鱼体肠道内菌群的平衡，拮抗病原菌，降低降解胆酸的细菌数目，促进机体对脂溶性营养物质的吸收，从而促进动物生长（杨汉博，2002；余成瑶等，1996；王红宁等，1994）。200～300 mg/kg地衣芽孢杆菌可使异育银鲫食糜蛋白酶和淀粉酶活性及肠道组织蛋白酶活性升高（刘波等，2005）。摄食含1.0×1011cfu/kg凝结芽孢杆菌的饲料后，奥尼罗非鱼的胃、肠道和肝胰脏蛋白酶活性显著提高（付天玺等，2008）。本试验也表明，添加芽孢杆菌能提高肝胰脏、血清、肠道胃蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活性，其中添加枯草芽孢杆菌和混合菌（地衣芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌）能显著提高肝胰脏淀粉酶、中肠胃蛋白酶及血清脂肪酶活性，其他组差异不显著可能与芽孢杆菌添加量有关。

微生态制剂可以提高鱼类肠道消化酶活性已被众多试验研究所证实，但目前对其机理的研究甚少。鱼体肠道消化酶活性的提高可能是由于饲料中添加的微生物刺激肠道或是由于长期采食所添加的微生物引起肠的适应性分泌而致；或摄入的有益菌分泌的酶能在鱼体能发生作用，而使鱼体肠内蛋白酶、淀粉酶活力升高。关于微生态制剂提高鱼类消化酶活性的机理还有待于进一步研究。

4 小结

在本试验条件下，饲料中添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌均能促进彭泽鲫生长，提高消化酶活性，调节肠道健康；其中复合芽孢杆菌对肠道结构及酶活性的影响效果最佳。但对于不同芽孢杆菌的最适添加量还有待进一步研究。