超声波辅助溶剂法提取沙棘果油工艺优化及其抗氧化活性研究

林可，王斌*，张丹丹，葛正凯，薛丕卫,2

(1.石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000；2.新疆伊犁金康苏沙棘产业开发有限公司，新疆 伊犁 835000)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)，属胡颓子科(Elaeagnaceae)落叶灌木或小乔木，又名醋柳、黑刺、酸刺，主要在东经2°～123°，北纬 27°～69°之间亚欧大陆的温带地区[1]。沙棘耐寒，耐旱，耐风沙，耐土壤贫瘠，适合在我国西北、华北、东北、西南等地区种植。中国是沙棘的发源地，沙棘的种植面积和产量占世界总量的90%以上。而新疆作为中国沙棘的故乡，其沙棘总产量达到全国的50%以上。沙棘的根、茎、叶、花、果实都含有生理活性物质，其中，沙棘果实中的天然活性成分含量最高，具有良好的药用和保健价值[2-3]。作为沙棘果实中最有价值的组分之一，沙棘油富含维生素、胡萝卜素、黄酮类化合物、脂肪酸、叶酸、8种必需氨基酸和多种微量元素等，对烧伤、溃疡等疾病有特殊疗效，同时还具有抗辐射、抗衰老、调节人体免疫力、缓解动脉粥样硬化等功效，使其在医药、保健食品、美容化妆品等领域被广泛应用，具有巨大的潜在应用价值[4]。

当前，常用的提取沙棘果油油脂的方法主要有超临界CO2萃取法、有机溶剂萃取法、水代法、水酶法、超声波辅助法和微波辅助法等[5-6]。有机溶剂萃取根据相似相溶原理，选择与物料极性相近的有机溶剂最大程度地分离油脂，在工业生产中是一种相对简单的油脂提取方法。超声波的作用主要是空化效应，在超声波作用下，空化泡能瞬间涨大并破裂，产生高达几千个大气压瞬时压力，同时伴有强大冲击波和微声流，从而将细胞壁结构破坏，胞内油脂得以释放，提高出油率[7-9]。近年来，超声波辅助与有机溶剂相结合的提取技术因具有提取时间短、效率高、可提高油脂品质等优点，广泛应用于天然产物的提取[10]。研究表明，超声波的使用能够促进有机溶剂提取油脂的效果进一步提高。

新疆沙棘资源丰富，沙棘果具有极高的生物活性。本研究通过单因素试验和正交试验，采用超声波辅助有机溶剂提取新疆沙棘果油，并探讨了提取沙棘果油的抗氧化效果，为新疆地区沙棘果油的提取与应用提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用的沙棘原浆来源于新疆伊犁金康苏沙棘产业开发有限公司，用车载冰箱运输，于-20 ℃保藏；石油醚(60～90 ℃)、正己烷、乙酸乙酯：均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、DPPH溶液、ABTS溶液、过硫酸钾、结晶紫、硫酸亚铁、磷酸、柠檬酸、过氧化氢、VC：均为分析纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ250-DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；日本YAMATO旋转蒸发仪 重庆雅马拓科技有限公司；津腾溶剂过滤器 天津市津腾实验设备有限公司；756PC紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 沙棘果油提取工艺流程

沙棘果实→挤压破碎→分离沙棘籽→沙棘原浆→加有机溶剂→超声辅助提取(多次)→静置分离→旋转蒸发回收有机溶剂→烧瓶冷却至室温称重→差量法获得沙棘果油质量。每组试验平行3次，采用最小显著差异的方法对单因素试验进行方差分析。

1.3.2 提取率的计算

式中：R是沙棘果油的提取率，%；M1是沙棘果油和蒸馏烧瓶的质量，g；M2是蒸馏烧瓶的质量，g；M是沙棘原浆的质量，g。

1.3.3 单因素试验

称量沙棘原浆10.00 g，在超声波功率为200 W、超声频率为45 kHz的条件下，按照上述试验步骤，以料液比为1∶6 (g/mL)在样品中分别加入有机溶剂石油醚、正己烷和乙酸乙酯，提取时间设定为20 min，以沙棘果油的提取率确定最佳的提取溶剂。

最佳提取溶剂确定后，以提取温度40，45，50，55，60 ℃，提取时间15，20，25，30，35 min，料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 (g/mL)，提取次数1，2，3，4次，采用单因素试验研究这4个因素对沙棘果油提取率的影响，每组试验平行3次。

1.3.4 正交试验

以单因素试验为基础，选取提取温度、提取时间、料液比、提取次数设计4因素3水平的正交试验。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.3.5 沙棘果油抗氧化活性的测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

参考史亚男等[11]的方法，用无水乙醇分别配制不同浓度的沙棘果油待测溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，准确吸取待测溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均匀，在黑暗条件下静置30 min。以无水乙醇调零，并用紫外分光光度计测定其在波长为517 nm处的吸光值A样品；测定样品溶液2.0 mL与无水乙醇2.0 mL混合液的吸光值A对照；最后测定2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL无水乙醇的吸光值A空白。每组试验测定3次，并以平均值绘图。以VC为阳性对照，使用前以蒸馏水配制质量浓度与沙棘果油相同的对照液。用蒸馏水为空白对照，每个浓度测定3次，计算公式如下：

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力

参考崔同等[12]的方法，在室温下，先以5 mL ABTS溶液(7 mmol/L)与88 μL的K2S2O3溶液(140 mmol/L)充分混合，在黑暗条件下静置过夜，得到ABTS储备液。之后用无水乙醇稀释，并在波长为734 nm下测定，使稀释后的储备液的吸光度为0.70±0.02。用无水乙醇配制不同浓度的沙棘果油待测溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，取不同的待测溶液100 μL，并加入0.9 mL的ABTS稀释液，使其反应1 min，测定吸光度为A样品；测定稀释后的ABTS溶液的吸光度为A对照。每个浓度测定3次，并以平均值绘图。将VC作为阳性对照，使用前以蒸馏水配制质量浓度与沙棘果油溶液相同的对照液。用蒸馏水做空白对照，每个浓度测定3次。上述的检测波长均为734 nm，计算公式如下：

1.3.5.3 羟自由基清除能力

参考高燕[13]的方法，用无水乙醇分别配制不同浓度的沙棘果油待测溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，在25 mL的具塞比色管中分别加入0.3 mL结晶紫溶液(0.4 mmol/L)、0.6 mL H2O2溶液(2.0 mmol/L)和1.2 mL FeSO4(1.0 mmol/L)溶液。将上述溶液用磷酸-柠檬酸缓冲溶液(pH 4.0)定容至10 mL，充分振荡摇匀后静置30 min，测其吸光度Ab，同时测定不加H2O2的吸光度A0，测定波长为580 nm。在加H2O2之前分别在上述体系中加入不同浓度的待测液2 mL，测定其吸光度为As。每个浓度测定3次，并以平均值绘图。以VC作为阳性对照，使用前用蒸馏水配制质量浓度与沙棘果油溶液相同的对照液。用蒸馏水做空白对照，每个浓度测定3次，计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 有机溶剂对沙棘果油提取率的影响

根据“相似相溶”原理，正己烷、石油醚、乙酸乙酯和乙醇等有机溶剂被广泛用于提取植物油脂。本研究以沙棘果油提取率为指标，依据溶剂的介电常数和脱溶难易程度考察了3种常用的有机溶剂即正己烷、石油醚、乙酸乙酯对沙棘果油提取率的影响。本研究在沙棘原浆10.00 g、超声功率200 W、超声频率45 kHz、超声温度45 ℃、超声处理时间20 min、料液比1∶6 (g/mL)、提取次数为1次的条件下，考察了正己烷、石油醚、乙酸乙酯对沙棘果油提取率的影响，结果见图1。

图1 有机溶剂的影响Fig.1 The effect of organic solvents

由图1可知，采用不同有机溶剂提取沙棘果油时，提取率存在显著差异，其中石油醚的提取率最高，达到1.1%。正己烷的提取率为0.4%，提取效果最差。因此，本研究以石油醚为萃取溶剂用于后期沙棘果油的提取。

2.1.2 超声处理时间对沙棘果油提取率的影响

超声处理时间的增加可以使原料和溶剂充分接触，从而加快油脂溶出，提高提取率。本研究在沙棘原浆10.00 g、超声功率200 W、超声频率45 kHz、超声温度45 ℃、提取次数为1次的条件下，以石油醚为提取溶剂，料液比为1∶6时，考察了不同超声处理时间15，20，25，30，35 min对沙棘果油提取率的影响，结果见图2。

图2 超声时间的影响Fig.2 The effect of ultrasonic time

由图2可知，由于原料中提取物的含量是一定的，随着超声时间的延长，超声波对物料的作用更加充分，沙棘果油的提取率增大，当达到一定时间后，提取率反而下降，可能是由于过长的超声时间会引起热效应，导致有机溶剂挥发，并发生了油脂夹带的现象[14]。结果表明，超声处理时间为25 min时沙棘果油的提取率可达0.7%。因此，选取25 min作为最佳超声处理时间。

2.1.3 超声温度对沙棘果油提取率的影响

分子动能大小受温度的影响，升温可以加快分子运动速度，促进分子扩散。本研究在沙棘原浆10.00 g、超声功率200 W、超声频率45 kHz、超声时间25 min、提取次数为1次的条件下，以石油醚为提取溶剂，料液比为1∶6时，考察不同超声温度40，45，50，55，60 ℃对沙棘果油提取率的影响，结果见图3。

图3 超声温度的影响Fig.3 The effect of ultrasonic temperature

由图3可知，当超声温度从40 ℃提高到50 ℃时，沙棘果油的提取率不断增加。这是因为温度的升高加快了有机溶剂和油脂分子的运动速度，促进了油脂的扩散。但继续增加超声温度，沙棘果油的提取率反而下降，这可能是由于温度接近有机溶剂石油醚的沸点时，部分石油醚挥发，沙棘果油提取率下降，或者在石油醚挥发过程中夹带了一些挥发性物质。因此，选取50 ℃作为最佳超声温度。

2.1.4 料液比对沙棘果油提取率的影响

提取率受料液比的影响，料液比过低或过高都会造成提取率下降。在提取过程中，料液比过低不易溶出提取物，过高则会浪费溶剂同时也会使提取物被稀释。因此，为了提高提取率，选择最佳的料液比至关重要。本研究在沙棘原浆10.00 g、超声功率200 W、超声频率45 kHz、超声时间25 min、超声温度50 ℃、提取次数为1次的条件下，以石油醚为提取溶剂，考察不同料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 (g/mL)对沙棘果油提取率的影响，结果见图4。

图4 料液比的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio

由图4可知，在料液比由1∶2增加到1∶6时，沙棘果油的提取率显著提高，料液比为1∶6时提取率达到0.6%。继续增加料液比，沙棘果油的提取率反而下降。这是由于石油醚用量增加，沙棘原浆与石油醚的浓度差增大，浓度差越大，沙棘果油越容易溶出，当石油醚用量增加到一定值后，由于沙棘原浆中油脂含量逐渐减少，因此石油醚的增加不能使更多的油脂溶出，并且还会导致回收时间的延长，造成沙棘果油的浪费。因此，选取1∶6作为最佳料液比。

2.1.5 提取次数对沙棘果油提取率的影响

随着提取次数的增加，原料在溶剂中得到充分溶解。但次数过多不仅浪费溶剂，而且提取时间也会相应增长，从而导致提取成本增加。本研究在沙棘原浆10.00 g、超声功率200 W、超声频率45 kHz、超声时间25 min、超声温度50 ℃，以石油醚为提取溶剂，料液比为1∶6时，考察不同提取次数，1，2，3，4次对沙棘果油提取率的影响，结果见图5。

图5 提取次数的影响Fig.5 The effect of extraction times

由图5可知，在超声功率为200 W、超声频率为45 kHz、超声处理时间为25 min、超声温度为50 ℃时，以料液比1∶6对沙棘原浆进行多次提取，比较提取率，在对沙棘原浆提取2次时，提取率为0.9%，随着提取次数的增加，提取3次和4次时提取率均为1.0%，仅比提取2次时提高了0.1%。这可能是因为在提取2次时沙棘果油已基本溶出，再增加提取次数并不能溶出更多的沙棘果油。并且随着提取次数的增多，滤液浓缩时间会增长，一定程度上给浓缩带来困难。因此，选取2次作为最佳提取次数。

2.2 沙棘果油提取条件的正交试验优化

正交试验结果见表2，由极差分析结果可以看出，各因素对沙棘果油提取率的影响有明显差别，其影响顺序为B>D>C>A，即提取时间>提取次数>料液比>提取温度。各主次因素最优水平组成最优提取工艺条件，为A3B2C1D2，即提取温度55 ℃、提取时间25 min、料液比1∶4、提取次数2次为最优提取工艺组合。

表2 沙棘果油提取L9(43)正交试验优化结果Table 2 The optimized results of orthogonal test L9(43)for extraction of sea buckthorn fruit oil

以石油醚为提取溶剂，在超声功率200 W、超声频率45 kHz、提取温度50 ℃、提取时间25 min、料液比1∶4、提取次数2次的条件下对沙棘果油进行提取，提取率达1.1%，优于表2中每组提取结果，因此，A3B2C1D2为最佳提取工艺组合。

2.3 沙棘果油抗氧化活性测定

2.3.1 沙棘果油对DPPH自由基的清除能力

1,1-二苯基-2-苦基苯肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)是一种稳定的有机自由基和具有特征的紫红色团吸收峰，当自由基清除剂存在时，与DPPH的单电子配对从而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与所接收的电子数呈定量关系，因此可用分光光度法进行测定分析[15]。

图6 沙棘果油和VC对DPPH的清除率Fig.6 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on DPPH free radical

由图6可知，在选择的沙棘果油溶液浓度范围内，DPPH自由基清除率与浓度呈正相关，在浓度范围为0～10 mg/mL时，清除率随着浓度增加而快速增加，在浓度范围为10～20 mg/mL时，清除率增加相对缓慢且最终趋于平衡，最终的清除率达到96.5%，与VC清除DPPH自由基的清除率相近。而在同样的浓度范围内，DPPH自由基清除率随着VC浓度的增加无明显变化，接近100%。在DPPH自由基清除试验中，VC的IC50值为0.98 mg/mL，而沙棘果油的IC50值为4.47 mg/mL，是VC的0.22倍，此时所需的沙棘原浆为406.36 mg。

2.3.2 沙棘果油对ABTS自由基的清除能力

ABTS法是根据对电子的转移和对有色物质的还原来测定抗氧化活性的。在ABTS自由基反应中，抗氧化活性是以抗氧化剂抑制蓝绿色的ABTS自由基的产生来评价的。

图7 沙棘果油和VC对ABTS的清除率Fig.7 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on ABTS free radical

由图7可知，在选择的浓度范围内，ABTS自由基清除率与浓度呈良好的线性关系，在浓度范围为2～20 mg/mL时，沙棘果油的ABTS自由基清除能力由9.50%增加到73.20%，而VC对ABTS自由基的清除能力在同样的浓度范围内基本保持不变，维持在100%左右。在DPPH自由基清除试验中，VC的IC50值为0.98 mg/mL，而沙棘果油的IC50值为11.22 mg/mL，是VC的0.09倍，此时所需的沙棘原浆为1020 mg。

2.3.3 沙棘果油对羟自由基的清除能力

羟自由基是一种广泛存在于生物体内的高细胞毒性自由基，它能引起胞内蛋白质、核酸等物质的损伤，导致各种疾病和机体衰老现象，反应速度很快。

图8 沙棘果油和VC对·OH的清除率Fig.8 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on·OH free radical

由图8可知，在选择的浓度范围内，沙棘果油和VC对羟自由基的清除能力几乎呈线性上升，显现量效关系。在DPPH自由基清除试验中，VC的IC50值为10.12 mg/mL，而沙棘果油的IC50值为19.05 mg/mL，是VC的0.53倍，此时所需的沙棘原浆为1731 mg。

正常情况下，体内活性氧化物处于动态平衡状态，它的产生和消失有一定运作机制。一但某些原因打破这种动态平衡状态，导致体内氧化物增多或机体清除氧化物能力下降，机体就会产生应激现象。当机体不能及时有效地调节这种状态时，活性氧化物的含量就会相对增加，对机体产生危害。为了机体免受细胞氧化物的损害，可以合理使用抗氧化剂和自由基清除剂保护机体。本文研究表明，沙棘果油能够有效清除DPPH、ABTS以及羟自由基等活性氧化物，可以作为一种抗氧化剂。

3 结论

在本研究中，提取沙棘果油较为理想的有机溶剂为石油醚。以单因素试验为基础，采用正交试验优化沙棘果油的提取工艺，结果显示：对提取率有影响的4个因素中，影响最大的为提取时间，最小的为提取温度，其影响顺序为提取时间>提取次数>料液比>提取温度。正交试验优化的结果为提取温度55 ℃、提取时间25 min、料液比1∶4、提取次数2次。体外抗氧化试验表明，沙棘果油对DPPH、ABTS和羟自由基的IC50值分别为4.47，11.22，19.05 mg/mL，分别是VC清除DPPH、ABTS和羟自由基的0.22，0.09，0.53倍，此时所需的沙棘原浆分别为406.36，1020，1731 mg。