酶联美拉德反应制备天然烤花生风味物质的研究

庄荣旭，马颖川，赖升敬，罗妍，汪薇,2*

(1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广州 510225；2.广东省香精香料(仲恺)工程技术研究中心，广州 510225；3.华南农业大学 食品学院，广州 510642；4.广东省盐业集团揭阳有限公司，广东 揭阳 522000)

中国是世界上重要的花生生产国，总产量占世界花生产量的40%，居第一位，其中国内消费占总产量的95%以上。花生是一种广受消费者欢迎的食品，特别是在焙烤过程中产生的特殊风味深受消费者喜爱[1-2]。

近年来，随着人们消费观念的改变及消费水平的提高，天然香精以其绿色、天然、安全、环保等特点日益受到人们的青睐。烤花生香精是食品生产中一种重要的香味剂，能够赋予食品特殊的烤花生香味，具有极大的市场潜力，可以广泛应用于花生酱、花生味饮料、花生味蛋糕、花生味冰淇淋等食品中[3]。

目前有一些学者对花生风味物质进行了研究，黄文等用蛋白酶对脱脂花生进行酶解，然后与葡萄糖在丙二醇溶液中反应，以获得焙烤花生的香味[4]；在Gannis等的专利中采用加热浸泡过花生的丙三醇和水的混合溶液来制备花生风味[5]。但是这些研究中使用了有机溶剂，从安全的角度来看有所欠缺。陈文伟等采用花生粕酶解液与葡萄糖、氨基酸和硫胺素等在花生油中进行热反应，制备了花生香精，并通过GC-MS检测发现其主要呈香成分为吡嗪类、噻唑类、吡喃类化合物[6]。侯振建等的专利中通过热反应制备了花生香精，具有浓郁的坚果香气，适用于咸味食品[7]。而吴肖等则采用花生粕蛋白酶解液进行Maillard 反应后合成了肉类香味料[8]。

通过对花生风味物质的挥发性成分研究发现，主要风味成分除了吡嗪类化合物外，还有大量的醛类、酮类、酯类以及烯类化合物，其中苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛是花生风味的主要贡献物质[9-11]。

虽然美拉德反应在天然风味物质的制备上应用广泛，但是在天然烤花生风味物质的制备上应用的并不是很多。本研究以花生为原料，采用酶联美拉德反应，以期获得天然烤花生风味物质。

1 材料与方法

1.1 材料

花生：市售；诺维信风味蛋白酶和Novozym 37071水解蛋白酶：购于广州明曜商贸有限公司；Protease MSD、Protease A-2SD、Protamex、Lipase AY 30G、Lipase G50、Lipase MER、Lipase R：均由天野酶制剂(江苏)有限公司上海分公司赠送；L-脯氨酸：购于衡水昌昊生物科技有限公司；L-精氨酸(≥99%)、L-丙氨酸(≥99%)、L-缬氨酸(≥99%)：购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；L-赖氨酸(98%)、L-甘氨酸(≥99%)、L-天门冬氨酸(≥99%)、L-谷氨酸(≥99.5%)、D-木糖(98%)：购于上海晶纯生化科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖：购于广州一马科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生预处理

将一定量的花生仁置于烘烤托盘中，然后放入远红外线食品烘炉中于120 ℃烘烤1 h，自然冷却后，去红衣，用打粉机进行打粉，然后装于保鲜袋中密封，于4 ℃保存备用。

1.2.2 酶解

用天平称取一定量的花生粉置于锥形瓶中，按一定的比例加入蒸馏水，摇匀后静置10 min。待充分浸透后，置于90 ℃恒温水浴锅中水浴20 min。取出后冷却至室温，加入一定量的蛋白酶和脂肪酶，置于恒温摇床中酶解一定的时间，取出，于90 ℃灭酶 10 min。自然冷却至室温后，于3000 r/min离心15 min，取上清，待用。

1.2.3 美拉德反应

取酶解液，加入一定量的氨基酸和糖，在一定的温度下反应一定的时间后，于3000 r/min离心15 min，取上清，待用。

1.2.4 褐变程度的测定

取适当稀释的样液置于比色皿中，于420 nm的波长下，采用紫外分光光度计测定吸光值，其中吸光值反映出褐变程度。

1.2.5 感官评价标准

由5位感官评价成员对实验所得样品的风味进行评价，具体评分标准见表1。

表1 感官评价标准表Table 1 The sensory evaluation standard

2 结果与分析

2.1 酶解条件对酶解效果的影响

2.1.1 蛋白酶的种类对酶解效果的影响

蛋白酶可将花生中的蛋白质进行水解，产生多肽及氨基酸等风味物质。不同蛋白酶的酶解位点不同，会得到不同的酶解产物，从而得到具有不同风味的产物。

表2 蛋白酶的种类对酶解效果的影响Table 2 Effect of proteases＇ types on the enzymolysis effect

由表2可知，经诺维信风味蛋白酶酶解之后，其产物具有较浓郁的烤花生味和焦糖味，油脂味较淡，无不良的风味，且风味协调性好，优于其他几种蛋白酶。这可能是因为诺维信风味蛋白酶同时具备内切酶和外切酶的活性，能得到较丰富的风味物质，较好地提升了酶解物的感官品质。综合考虑，最适的蛋白酶以诺维信风味蛋白酶为宜。

2.1.2 脂肪酶种类对酶解效果的影响

脂肪酶的种类对酶解效果会产生较大影响，结果见表3。其中，Lipase MER和Lipase R的酶解产物都具有较浓郁的烤花生风味，且没有明显的油脂味。但是在风味的协调性上，Lipase MER要优于Lipase R，这可能是因为Lipase MER对中短链脂肪酸具有较强的水解能力，能产生烤花生风味的主要贡献物质。综合考虑，最适的脂肪酶以Lipase MER脂肪酶为宜。

表3 脂肪酶种类对酶解效果的影响Table 3 Effect of lipases＇ types on the enzymolysis effect

2.1.3 酶的比例对酶解效果的影响

表4 酶的比例对酶解效果的影响Table 4 Effect of ratios of proteases and lipases on the enzymolysis effect

由表4可知，当蛋白酶和脂肪酶的比例小于1∶1时，随着脂肪酶比例的增加，焦糖味和烤花生味均随之增强，但是当比例大于1∶1时，随着脂肪酶比例的增加，焦糖味和烤花生味均随之减弱。因此可见，当加入的蛋白酶和脂肪酶的比例为1∶1时，烤花生味较浓郁，焦糖味和油脂味适中，风味协调性好。综合考虑，复合酶的最适比例以1∶1为宜。

2.1.4 酶浓度对酶解效果的影响

表5 酶浓度对酶解效果的影响Table 5 Effect of content of enzymes on the enzymolysis effect

由表5可知，当酶浓度小于0.3%时，随着酶浓度的增加，产物的烤花生味显著增加，焦糖味和油脂味略有增加，风味协调性也随之增加。但是当酶浓度大于0.3%时，烤花生味、焦糖味和油脂味均迅速下降，风味的协调性也随之下降。综合考虑，最适的酶浓度以0.30%为宜。

2.1.5 料液比对酶解效果的影响

表6 料液比对酶解效果的影响Table 6 Effect of solid-liquid ratios on the enzymolysis effect

由表6可知，当料液比小于1∶3时，随着料液比的增加，烤花生味、焦糖味和油脂味迅速增加，风味协调性增强；而当料液比大于1∶3时，烤花生味、焦糖味和油脂味又呈现显著下降的趋势。这是因为料液比过低时，反应体系的流动性较差，不利于反应的发生；而料液比过高时，又会稀释底物和产物浓度，减缓反应速度。综合考虑，最适的料液比以1∶3为宜。

2.1.6 酶解时间对酶解效果的影响

表7 酶解时间对酶解效果的影响Table 7 Effect of enzymatic hydrolysis time on the enzymolysis effect

由表7可知，当酶解时间小于7 h时，随着酶解时间的增加，产物的烤花生味、焦糖味及风味协调性均随之上升；当酶解时间大于7 h时，随着酶解时间的继续增加，产物的烤花生风味和焦糖味稍有下降，油脂味明显下降，而且风味协调性下降比较明显，可能是因为酶解时间过长，将反应物中的大量油脂降解产生中短链脂肪酸所致。综合考虑，最适的酶解时间以7 h为宜。

2.2 美拉德反应条件对花生类风味物质的影响

美拉德反应也称羰氨反应，是一种非酶褐变，本质上是羰氨间的缩合反应，主要指的是醛、酮、还原糖的羰基与氨基酸、肽、蛋白质等含氮化合物的游离氨基之间发生的一系列反应，此反应会产生许多美拉德反应产物，如挥发性香气物质、高活性且有紫外吸收的中间产物和复杂的黑色高分子聚合物蛋白黑素等。

通过控制原材料、温度及加工方法，美拉德反应可制备各种不同风味、香味的物质。主要是采用还原糖和食品级的氮源如氨基酸、肽、蛋白质、植物水解蛋白及酵母提取物等多种物质混合加热制备所需的食品风味物质。此外，美拉德反应产生的香精香气饱满、醇厚味浓郁及仿真度较高[12-17]，因此，在食品风味物质的制备上被广泛应用。

2.2.1 氨基酸种类的影响

不同的氨基酸与还原糖通过美拉德反应能够产生不同的特征风味，如腊肉、鹅肉、咖啡风味香精等。本研究选择了脯氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸8种氨基酸分别与D-木糖和酶解液于110 ℃反应60 min，结果见表8。

表8 氨基酸种类对美拉德反应的影响Table 8 Effect of amino acids＇ types on the Maillard reaction

由表8可知，谷氨酸的加入有助于花生香味的增强，且油脂味微弱，风味协调性良好，感官评分总得分为13.5分，其他氨基酸反应后，所得产物的烤花生味较淡，且还会产生其他异味。此外，产物的吸光值可反映美拉德反应的褐变程度。谷氨酸所对应产物的吸光值最低，说明其褐变程度较低。综合考虑，最适的氨基酸以谷氨酸为宜。

2.2.2 糖种类的影响

本实验选取了蔗糖、D-木糖和葡萄糖分别参与美拉德反应，结果见表9。

表9 糖种类对美拉德反应的影响Table 9 Effect of saccharides＇ types on the Maillard reaction

由表9可知，D-木糖的加入有助于烤花生风味的产生，没有产生杂味，风味协调性较好，感官评分总得分为14.5分；加入葡萄糖反应后的产物虽也没有杂味，但其产物的花生风味较弱，感官评分总得分为10.5分。综合考虑，最适的糖以D-木糖为宜。

2.2.3 谷氨酸添加量的影响

表10 谷氨酸添加量对美拉德反应的影响Table 10 Effect of additive amount of glutamate on the Maillard reaction

由表10可知，当谷氨酸的用量小于1.5%时，随着谷氨酸用量的增加，烤花生风味物质的味道越来越浓，但是其添加量达到1.5%时，同时产生了明显的异味，破坏了产物的风味协调性。当谷氨酸的用量大于1.5%时，随着谷氨酸用量的增加，烤花生风味逐渐减弱，而酸味增强。综合考虑，最适的谷氨酸用量以花生粉质量的1.0%为宜，其反应产物的吸光值为1.3，风味较好的产物吸光值大约在1.3～2.0范围内。

2.2.4 D-木糖添加量的影响

表11 D-木糖添加量对美拉德反应的影响Table 11 Effect of additive amount of D-xylose on the Maillard reaction

由表11可知，当D-木糖添加量小于1.5%时，随着D-木糖添加量的上升，烤花生风味越来越浓，异味逐渐消失；当D-木糖添加量大于1.5%时，烤花生风味逐渐变淡，焦糖味变重，所产生的风味类似花生糖。综合考虑，最适的D-木糖用量以花生粉质量的1.5%为宜，其美拉德反应产物的吸光值为1.6，其风味较好的产物的吸光值大约在2.4～2.6范围内。

2.2.5 反应温度的影响

表12 反应温度对美拉德反应的影响Table 12 Effect of reaction temperature on the Maillard reaction

由表12可知，当美拉德反应温度低于110 ℃时，随着反应温度的上升，烤花生味越来越浓，油脂味微弱，协调性增加；当美拉德反应温度高于110 ℃时，随着反应温度的上升，油脂味变得浓郁，且产生令人不愉快的异味。综合考虑，最适的反应温度以110 ℃为宜，其美拉德反应产物的吸光值为1.9，风味较好的产物吸光值大约在1.6～1.8范围内。

2.2.6 反应时间的影响

表13 反应时间对美拉德反应的影响Table 13 Effect of reaction time on the Maillard reaction

由表13可知，当反应时间低于90 min时，随着美拉德反应时间的增加，烤花生味变得越来越浓郁；当反应时间大于90 min时，随着美拉德反应时间的增加，烤花生味变弱，且会产生异味。当反应时间为120 min时，会产生良好的番茄味。综合考虑，美拉德反应的最适时间以90 min为宜。

3 结论与展望

本文通过酶联美拉德反应可获得天然烤花生风味物质。花生酶解液的最佳制备条件为风味蛋白酶和Lipase MER的比例为1∶1，酶浓度为0.3%，料液比为1∶3，酶解温度和时间分别为50 ℃和7 h；美拉德反应的最佳条件为谷氨酸和D-木糖的添加量分别为酶解液质量的1.0%和1.5%，反应温度和时间为110 ℃和90 min，在此条件下得到的产物具有香浓的烤花生风味。

在研究的过程中偶然发现，用1.0%的谷氨酸和1.5% D-木糖与花生酶解液在110 ℃的条件下进行热反应120 min，所得样品具有良好的番茄味。用1.0%的谷氨酸和2.0% D-木糖与花生酶解液在110 ℃的条件下热反应120 min，所得样品具有良好的花生糖风味。因此，接下来可对天然花生糖风味物质和番茄风味物深入研究。此外，还可借助GC-MS、电子鼻、电子舌等现代高新实验设备对制得的各种风味物质成分进行检测分析，为烤花生风味物质的配制提供了理论依据。