红酸汤的抗氧化活性研究

周绍琴，李凤兰，吴映梅，刘小艺，张清海，周艳*

(1.贵州医科大学 公共卫生学院，贵阳 550025；2.贵州医科大学 环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳 550025)

红酸汤是贵州黔东南地区苗族人民的一种特色食品，以番茄为主要原料，经自然发酵而成，其色泽红亮，有“酸、鲜、香”的风味特征。将红酸汤用作火锅底料,口味醇厚、酸味纯正、咸味适中，具有增强食欲的独特作用，现已走向全国市场，深受国内消费者的青睐，它也被评定为继小肥羊、麻辣火锅后的中国第三大火锅底料。

自由基是机体在氧化反应过程中产生的有害化合物，具有强氧化性。当自由基清除过少或者产生过多时，会损害机体的细胞和组织，引发相关慢性疾病及衰老效应[1-2]。因此，适当补充天然抗氧化剂有利于机体自由基的清除。

番茄是红酸汤的主要原料，由于番茄中含有丰富的抗氧化物质，研究显示[3-7]：番茄中维生素C的含量为(116.76±5.29)mg/kg，番茄红素的含量为(15.65±0.48)mg/kg。因此，以番茄为主要原料制成的红酸汤具有一定的抗氧化能力。陈文莹等[8]研究显示：红酸汤中的全反式番茄红素含量为25 mg/100 g。鲁青松等[9-10]研究显示：红酸汤中有机酸有较好的O2-清除能力，将其制成口服液具有一定的抗氧化能力，其清除率DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基的IC50值分别为18.89%、37.79%、19.09%。但不同来源的红酸汤抗氧化物质的组成、自由基清除能力的差异、发挥自由基清除活性的主要物质尚不清楚。

因此，本试验选择贵州地区商业化和农家自制红酸汤产品为研究对象，检测不同来源的红酸汤中抗氧化物质(维生素C、总黄酮、总酚和番茄红素)的含量和自由基清除活性，并将两者进行相关性分析，探索影响红酸汤抗氧化活性的可能因素，为高抗氧化活性红酸汤产品的生产提供了理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料与试剂

通过网络和超市购买9个品牌(1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#)的红酸汤产品和农家自制产品1份，共10份，每份3个样品，共30个样品。产品的产地信息见表1。

表1 不同品牌的酸汤产地Table 1 The places of origin of different brands of sour soup

碳酸氢钠、碳酸钠、无水乙醇、草酸(均为分析纯):天津市科密欧化学试剂有限公司；DPPH标准品：北京索莱宝科技有限公司；L(+)抗坏血酸标准品。

1.1.2 主要仪器

721型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；超声仪 昆山市超声仪器有限公司；LT1002C型电子天平 常熟市天量仪器有限责任公司；TG16-WS台式高速离心机 常州朗越仪器制造有限公司；Agilent 1100型高效气相色谱仪、Agilent 1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 pH值的检测方法

采用pH计测定，每个样品平行测定3次。

1.2.2 滴定酸度的检测方法

参考国家标准GB/T 12293-1990[11]测定红酸汤的滴定酸度，将试样充分摇匀，用天平称取10 g，放入50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀待测，用滤纸过滤即得样品。用移液管吸取10 mL样液，加入酚酞指示剂5～10滴，用0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至出现微红色30 s内不褪色为终点，记下所消耗的体积V1。试样的可滴定酸度以每 100 g氢离子毫摩尔数表示，按下式计算：

1.2.3 维生素C的检测方法

参考国标GB 5009.86-2016[12]。称取各样品10 g于烧杯中，用偏磷酸溶液(20 g/L)转移至100 mL容量瓶中，并稀释至刻度，然后过滤。除去滤液颜色(每 1 g样品加0.4 g白陶土脱色后再过滤),然后取过滤液10 mL于50 mL锥形瓶中，用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉红色15 s不褪色为止。同时做空白试验，按下式计算维生素C含量：

式中：X为试样中L(+)-抗坏血酸含量，mg/100 g；V为滴定试样所消耗的2,6-二氯靛酚溶液的体积，mL；V0为滴定空白所消耗的2,6-二氯靛酚溶液的体积，mL；T为2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，即每毫升2，6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数；A为稀释倍数；m为试样质量，g。

1.2.4 总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteus法测定样品中总酚的含量[13]，并稍作修改。

标准曲线的绘制：准确称取没食子酸(0.110±0.001)g，用水溶解到100 mL 容量瓶中，配制成浓度为1000 mg/L的没食子酸溶液，以此溶液为母液，配制成浓度为0，10，20，30，40，50 mg/L的没食子酸标准溶液。分别取上述标准溶液1.0 mL，依次加入1 mL 福林酚、3 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10 mL，避光反应30 min，在765 nm 波长下测定系列标准溶液的吸光度。标准曲线方程为y=0.2004x+0.0268，R2=0.997。

样品的测定：取一定质量的红酸汤，离心后取1 mL上清液，依次加入1 mL福林酚、3 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10 mL，避光反应30 min，然后在765 nm下测其吸光度，其总酚含量由以没食子酸为标准物所得的标准曲线来计算。

1.2.5 总黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al(NO3)3法测定样品中总黄酮的含量[14]，并稍作修改。

标准曲线的绘制：采用60%甲醇溶解芦丁标准品，配制成浓度为1.0 mg/mL的溶液，稀释溶液配制成0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL的溶液，分别取上述溶液1 mL，各加入60% 甲醇3.0 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，混合均匀放置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，混合均匀放置6 min，然后加入 4% NaOH水溶液4.0 mL，定容至10 mL，混合均匀，反应15 min 后，以60%甲醇为空白对照，于500 nm下测定吸光度值，绘制标准曲线方程为y=1.7125x+0.0159，R2=0.999，单位为mg/mL。

样品测定：取一定质量的红酸汤以4500 r/min的转速离心后取上清液1 mL，取稀释一定倍数的上清液1 mL于试管中，加入60%甲醇3.0 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，混合均匀放置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，混合均匀放置6 min，而后加入 4% NaOH水溶液4.0 mL，定容至10 mL，混合均匀，反应 15 min后，以60%甲醇为空白对照，于500 nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算黄酮含量。

1.2.6 总番茄红素含量的检测方法

参考余越等[15]的方法绘制标准曲线：在1 mg的总番茄红素标准品中加入10 mL的乙酸乙酯进行溶解，配制成0.1 mg/mL的溶液；按照逐级稀释的方法，将总番茄红素标准品浓度配制成10，8，6，4，2 μg/mL。在450 nm的条件下测其吸光值，得到其标准曲线方程为y=0.1255x-0.0532，R2=0.997。

样品的测定：用95%的乙醇进行除杂处理，红酸汤样品与乙醇95%按照1∶5(g/mL)混合，振荡后静置15 min，以2000 r/min离心10 min，弃去上清液，并倒置离心管于滤纸上吸干。取前处理的1 g左右的红酸汤样品按照样品与溶剂为积比1∶8加入溶剂，在25 ℃恒温水浴锅中水浴30 min，然后过滤取滤液，取0.1 mL样品用乙酸乙酯定容到2 mL，在450 nm下测定其吸光度。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的检测方法

参考王胜利等[16]的方法并稍作修改，测定各样品DPPH自由基的清除能力。准确称取4 mg DPPH自由基用无水乙醇溶解并定容至150 mL，于4 ℃避光保存，备用。取一定质量的样品经4500 r/min离心5 min，取上清液。分别取稀释一定倍数的样品1 mL，加入DPPH自由基乙醇溶液4 mL，在室温下避光反应30 min，以无水乙醇代替样品为空白对照，测定其在517 nm处的吸光度，以无水乙醇代替样品为空白对照。DPPH消除率按照下式计算：消除率/%=[A0-(Ai-A1)/(A0-A1)]×100%。式中：空白吸光值为A0；样品吸光值为Ai；样品溶液本底的吸光值为A1。

1.2.8 ABTS自由基清除能力的检测方法

取7.4 mmol/L的ABTS原液与等量2.45 mmol/L过硫酸钾混合,在黑暗中放置12～14 h，将ABTS溶液用无水乙醇稀释至在734 nm波长处的吸光度为0.70±0.02，得到ABTS溶液[17-18]。样品经过离心后取40 μL，加水稀释至1 mL，加入6 mL ABTS溶液，混合均匀后在734 nm波长下测吸光度，以无水乙醇作为空白，ABTS清除率按照下式计算：清除率/%=[A0-(Ai-A1)/(A0-A1)]×100%。式中：空白吸光值为A0；样品吸光值为Ai；样品溶液本底的吸光值为A1。

1.3 数据处理

用Excel计算出样品的均值和标准差，用SPSS 13.0进行抗氧化物质、自由基清除率的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同品牌红酸汤滴定酸度和pH值

表2不同品牌红酸汤滴定酸度和pH值Table 2 The titrated acidity and pH values in different brands of red sour soup

由表2可知，10种样品滴定酸含量范围为12.17～44 mmol/100 g。除了1#样品外，其余所有样本的滴定酸度均高于农家自制，滴定酸最高的为3#样品。pH值范围为2.51～3.21。与常云鹤等[19]研究的红酸汤pH值相比，贵州不同品牌红酸汤及自制红酸汤的滴定酸及pH值较低，这可能与发酵工艺、原辅料等有关，发酵产物中的有机酸含量决定了红酸汤的酸度。邹大维[20]对凯里红酸汤有机酸的分析研究表明，乳酸和乙酸为主要的有机酸。乳酸含量较乙酸高(1#样品除外)，其含量在26.26～96.51 g/kg之间，自制样品中乳酸含量为67.82 g/kg，2#、3#和7#样品乳酸的含量高于自制样品。乳酸可以作为人体细胞进行糖异生(由非糖物质转化成葡萄糖的过程)的原料，糖异生是人体饥饿时自体补充血糖的重要途径[21]，因此，可根据需求选择适宜的品牌。乙酸的含量在7.74～33.18 g/kg之间，自制乙酸含量为12.79 g/kg，除8#样品外，其余品牌乙酸的含量均高于自制。

2.2 不同品牌红酸汤中抗氧化物质的含量

维生素C、黄酮、多酚和番茄红素都是重要的抗氧化物质，对10个样品中维生素C、总黄酮、总酚和番茄红素的含量进行检测，见表3。

表3 不同品牌红酸汤中维生素C、总黄酮、总酚、番茄红素的含量Table 3 The content of vitamin C,total flavonoids,total phenols,lycopene in different brands of red sour

由表3可知，10种样品维生素C含量范围在1.92～7.27 mg/100 g，仅1#、3#和5#样品维生素C的含量低于农家自制，其中4#样品的维生素C含量最高，为7.27 mg/100 g。总黄酮含量范围在9.99～78.07 mg/100 g，仅2#、7#和9#样品总黄酮的含量高于或接近农家自制，其中7#样品总黄酮含量最高，为78.07 mg/100 g。总酚含量范围在168.43～411.94 mg/100 g之间，仅2#样品中的总酚含量高于农家自制，其含量为411 mg/100 g，其他市售红酸汤总酚含量集中在168～332 mg/100 g。番茄红素含量范围是5.98～54.32 mg/100 g，其中农家自制红酸汤番茄红素含量最高，为55.02 mg/100 g，其次是 8#样品，其含量为54.32 mg/100 g。由以上数据可知，商业化生产的红酸汤中维生素C的含量大部分不低于农家自制，但总黄酮、总酚和番茄红素含量高，大部分商业化生产的红酸汤低于农家自制。此外，农家自制红酸汤中的番茄红素含量高于鲁杨等[22]研究的红酸汤，其仅含(9.31±5.95)mg/100 g。

2.3 不同品牌红酸汤自由基清除率

表4 红酸汤DPPH、ABTS自由基清除率Table 4 The scavenging rates of DPPH,ABTS free radals of red sour

由表4可知，不同品牌红酸汤抗氧化物质的含量差别很大，抗氧化物质的含量将直接影响自由基的清除能力，因此，对不同品牌红酸汤自由基的清除能力进行测定。10种样品的DPPH清除率在40.85%～71.77%之间，其中2#样品的DPPH自由基清除率最高，为71.77%，2#、3#、4#和8#样品DPPH自由基清除能力高于农家自制；10种样品的ABTS自由基清除率在40.62%～70.34%之间，最高的为农家自制样品，为70.34%。

2.4 抗氧化物质与自由基清除活性的相关性分析

为了找出影响红酸汤抗氧化活性的主要物质，将抗氧化物质与自由基清除率进行相关性分析，结果见表5。

表5 抗氧化物质、自由基清除率相关性分析Table 5 The correlation analysis of antioxidant substances and free radical scavenging rates

由表5可知，红酸汤中总黄酮的含量与ABTS自由基清除率呈显著的正相关性(P=0.00，R=0.82)，说明红酸汤中黄酮含量越高，该样品ABTS自由基清除率越好。多酚与ABTS、DPPH自由基清除率都具有显著正相关性，说明样品中总酚的含量越高，样品对DPPH和ABTS自由基的清除率活性越强。Vc和番茄红素的含量与自由基清除之间无显著相关性，此结果预示着影响红酸汤抗氧化活性的主要物质是总酚和总黄酮。

3 结论

通过以上的试验结果可知，商业生产的红酸汤产品与农家自制产品差异不大，优于农家自制。红酸汤具有一定的抗氧化能力，Vc在商业品牌中的含量普遍高于农家自制，但总黄酮、多酚和番茄红素含量比农家自制略低；在自由基清除能力上，绝大部分品牌的红酸汤低于农家自制；影响红酸汤抗氧化活性的主要物质成分是总黄酮和多酚。进一步研究红酸汤在酿造过程中多酚和黄酮的变化趋势及其组成，研究能保持或提高红酸汤抗氧化活性的方式。