甲状腺乳头状癌肿瘤出芽情况与临床病理特征相关性研究

房 芹,白玉勤

(1.锦州医科大学,辽宁 锦州121000；2.赤峰学院附属医院，内蒙古 赤峰 024000)

甲状腺癌是一种常见的内分泌系统癌症之一，如今随着检查技术的提高，发现率逐年增加。据国外统计，近30年发病人数已增加至3倍，且癌症发病率排前三[1-3]。甲状腺癌一般见于女性，平均年龄为30～50岁。甲状腺癌有好几种分型，如乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌以及髓样癌。其中甲状腺乳头状癌最常见，甲状腺微乳头状癌主要是指肿瘤直径≤1.0 cm的甲状腺癌，甲状腺癌严重危害人类身体健康，对患者心理状态也造成不良影响[4]。肿瘤出芽是存在于肿瘤浸润前缘、散在的呈未分化形态的单个肿瘤细胞或4个细胞构成的小灶状肿瘤细胞群[5]。甲状腺一般随着病情进展，出芽表示肿瘤有侵袭发展及转移的可能性，所以一般提示甲状腺乳头状癌有恶性发展的可能性，预后一般不佳。而且有多个学者[6]表示肿瘤出芽是反映肿瘤侵袭能力和预后的不良因素，比如可用于评估胃肠道、鼻咽、胰腺、肺、食管、盆腔等各个脏器的恶性肿瘤，对于患者预后具有良好提示作用。本文选取在我院外科住院的甲状腺癌乳头状癌患者，所有患者均行根治手术治疗，共319例。采用HE染色和免疫组化法，光镜下检测出甲状腺乳头状癌肿瘤出芽情况，研究出芽与否和临床病理特征的相关性，为临床上及早发现预后不良因素提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012—2020年在我院外科行根治手术的甲状腺癌乳头状癌患者共319例作为研究对象。病例纳入标准：①临床病理信息以及病历资料完整，且无其他系统疾病；②患者经针吸细胞学病理学检查确诊为甲状腺乳头状癌；③所有患者术前均未经过化放疗。排除标准：①严重肝肾功能不全及血液系统疾病或患有其他系统的恶性肿瘤；②伴有严重心脑肾等脏器损伤、精神和神经异常以及临床资料不全的患者；③意识不清的患者。所有患者自愿参与本研究并签署相关知情同意书。其中男性61例，女性258例。年龄33～74 岁，平均(65.9±11.6)岁，以50岁进行分析，年龄≤50岁为163例，年龄>50岁为156例。肿瘤直径≥1 cm有70例，<1 cm有249例；临床T分期中T1-T2期231例，T3-T4期88例；病理分期中Ⅰ-Ⅱ期219例，Ⅲ-Ⅳ期100例；有淋巴结转移患者87例，未发生转移者232例；40例发生周围神经侵袭，279例未发生；121例患者发生被膜侵犯，有单侧病灶患者为187例。

1.2 免疫组化方法及染色 将取出的所有甲状腺乳头状癌患者标本快速浸泡在10%中性甲醛溶液中固定，然后将厚度为3 μm的石蜡包埋切片在72 ℃烘烤1 h。然后将石蜡切片浸泡在二甲苯Ⅰ溶液中10 min，时间控制在5 min。二甲苯Ⅱ脱蜡5 min。石蜡切片在室温下浸泡在梯度洗脱液中，乙醇浓度分别为95%、90%和85%各1 min，然后用流水冲洗2 min。1%盐酸乙醇分化20 s，自来水冲洗5 min，变成蓝色。用蒸馏水洗涤1 min。伊红染色20 s至5 min，自来水冲洗30 s。浓度分别为85%，95%和无水乙醇Ⅱ的酒精精梯度再洗脱。染色和洗脱完成后，用二甲苯使切片透明，然后用中性胶密封切片，在适当的放大倍数下观察切片。采用SP法进行免疫组化染色。石蜡切片脱蜡至水:连续切片(3 μm)， 72 ℃烘干1 h。将切片依次放入二甲苯脱蜡2～3缸，10 min/缸，梯度酒精100%、100%、95%、75%，2 min/缸;PBS洗涤5次，2 min/次。高压修复:将修复液放入高压锅中预热。煮沸后，将置于塑料染色架上的玻片放入修复液中，修复液必须完全覆盖;盖组织。限压阀转动空气喷射后，启动定时2.5 min，同时将电磁炉由高火调至中火。从热源处取出，用冷水冷却至室温。PBS洗涤3～5次，2 min/次。阻断内源性过氧化物酶并封闭:将切片置于3%过氧化氢中，室温孵育10～15 min;清洗蒸馏水至干净，用PAP笔画圈。PBS洗涤3～5次，2 min/次。加一抗，二抗加入，再进行DAB显色，复染细胞核，最后用自来水冲洗。脱水封片时逐步梯度酒精脱水，二甲苯透明，密封片。

1.3 观察指标 ①观察甲状腺乳头状癌的肿瘤出芽率，包括低出芽和高出芽率，判断标准按照Ueno等[7]的标准，在肿瘤浸润前沿的间质内见到单个孤立的肿瘤细胞，肿瘤出芽为不超过4个的小簇状肿瘤细胞群，无出芽一般指最深间质内未见到单个癌细胞或癌巢。②有无出芽患者在年龄、性别、肿瘤直径大小、肿瘤病灶、临床TNM分期、有无被膜侵犯、有无淋巴结转移、是否侵犯周围神经以及病理分期等具体例数。

2 结 果

2.1 甲状腺乳头状癌肿瘤性出芽情况 甲状腺乳头状癌有出芽的患者为111例，无出芽患者为208例，HE染色(图1A)、CK19标记(图1B)是低倍镜下(40倍)观察，随机选择两处肿瘤高出芽处(图1C、D)400镜下放大继续观察肿瘤出芽，镜下可见CK19标记的肿瘤灶，计数出芽数量≥10个/HPF，即为高出芽。HE染色(图1C)、CK19标记(图1D)观察肿瘤出芽情况为低度出芽，计数出芽数量<10个/HPF。HE染色(图2A)、CK19标记(图2B)在100倍光镜下未能观察到在肿瘤浸润前缘，与正常组织交界的区域，区域内的单个或小灶状癌细胞群组成的芽孢，即无出芽，图2C、D为低出芽。

A：HE染色,×40;B：CK19免疫组化标记,×40;C、D：B图出芽部位放大,×400

A、B：甲状腺乳头状癌不出芽；C、D：甲状腺乳头状癌低度出芽;A、C：HE染色,×40；B、D：CK19蛋白免疫组化染色,×40

2.2 甲状腺乳头状癌肿瘤出芽与临床病理特征关系 甲状腺乳头状癌出芽率为34.80%，为111例，无出芽患者为65.20%，为208例。两组乳头状癌患者年龄、性别、肿瘤的直径大小、肿瘤的单双侧病灶等因素比较均无统计学差异(均P>0.05)；而有无被膜侵犯、是否发生淋巴结转移、病理分期、临床T分期以及是否侵犯周围神经等因素比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 甲状腺乳头状癌肿瘤出芽与临床病理特征关系(例)

2.3 甲状腺乳头状癌高低出芽率与临床病理特征关系 出芽的患者中低出芽56例，高出芽55例，其中高出芽的患者发生被膜侵犯、有淋巴结转移、病理Ⅲ-Ⅳ期、临床T3-T4分期以及侵犯周围神经例数明显高于低出芽患者，差异具有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 甲状腺乳头状癌高低出芽率与临床病理特征关系(例)

3 讨 论

早期甲状腺乳头状癌临床表现并不显著，查体时可在甲状腺触及表面肿块，一般无压痛。甲状腺肿块一般发生在一侧腺叶，甚至发生淋巴结转移会有吞咽困难、声音嘶哑等，一般女性患者患病率高于男性，此病首选彩超检查，初步诊断率不高[8-11]。甲状腺癌的临床分型一般是分化型，且以乳头状和滤泡状较常见，甲状腺乳头状癌的组织学特点为细胞核大且聚集重叠，一般呈现出毛玻璃样核、核沟、核内包涵体等[12]。甲状腺乳头状癌的发病原因较多，有碘摄入量不足，遗传因素，矿物质等化学污染等原因，甲状腺乳头状癌手术方式一般采取根治手术[13]。甲状腺癌的预后较好，有研究表示普通患者生存时间可达10年以上，有远处淋巴结转移的患者稍短一般可至5年左右[14-15]。Lee 等[16]表示肿瘤出芽是肿瘤发生侵袭及淋巴结转移等预后不良的相关因素之一。

本研究中，甲状腺乳头状癌的肿瘤出芽与否与年龄、性别、肿瘤的直径大小、肿瘤是否为单双侧病灶关系不大；甲状腺乳头状癌肿瘤有出芽表示有被膜侵犯、临床分期、病理分期、发生淋巴结转移以及周围神经侵犯的可能性更大。这与卢巍等[17]研究结果具有相似之处，患者肿瘤出芽会受到临床分期以及淋巴结转移等因素的影响，而与患者的年龄、肿瘤大小及位置、病理类型以及多中心癌灶等多种因素没有影响。有研究表明肿瘤病灶直径越大的甲状腺乳头状癌发生淋巴结转移的可能性越大。对应的甲状腺癌肿瘤病灶直径越小，淋巴结转移率就越低[18-19]。这也与本研究具有相似之处。

另外研究还发现，高出芽的患者发生被膜侵犯、有淋巴结转移、病理Ⅲ-Ⅳ期、临床T3-T4分期以及侵犯周围神经例数明显高于低出芽患者，差异具有统计学意义;此说明高出芽肿瘤患者预后不及低出芽患者，高出芽甲状腺乳头状肿瘤患者更容易发现淋巴结转移等。Sumeyye等[20]研究发现有肿瘤出芽的患者发生淋巴结转移率明显高于无出芽的患者而且发现有肿瘤出芽的患者发生侵袭及淋巴结转移的可能性更大。而且高出芽患者生存时间较低出芽患者短，预后更差，差异有统计学差异，与本研究结果有相似。

综上所述，甲状腺乳头状癌的肿瘤出芽与临床病理特征关系密切，甲状腺乳头状癌肿瘤有无出芽与年龄、性别、肿瘤的直径大小、肿瘤的单双侧病灶没有关系；而与有无被膜侵犯、是否发生淋巴结转移、病理分期、临床T分期以及是否侵犯周围神经等因素有关，且高出芽肿瘤患者预后不及低出芽患者，差异显著,为今后临床工作者及早发现预后不良患者提供参考。