基于exoRBase外泌体数据库结直肠癌竞争性内源RNA网络构建及富集分析

马 骞，朱 军，蔡梦珊，郝 俊，章屹然，陈 睿

(1.西安医学院，陕西 西安710021；2.空军军医大学西京医院，陕西 西安710032；3.空军军医大学基础医学院，陕西 西安 710032)

恶性肿瘤作为全球严峻的公共卫生问题之一，极大地危害着人类的健康，已成为世界范围内首要死因，占全世界死因的13%[1]。而结直肠癌(Colorectal carcinoma，CRC)是世界上第三大常见癌症，也是导致癌症死亡的第四大原因，在前期诊断、医疗保健费用和卫生服务利用等方面造成了沉重的公共卫生负担[2-3]。CRC发病率和病死率总体呈上升趋势，有效地实施筛查技术和减少接触高危因素是降低CRC发病的根本措施。虽然临床诊断和治疗技术不断提高，但由于缺乏有效的干预措施和早期诊断的特异性生物标志物，CRC患者预后不理想(尤其是晚期CRC患者)且5年生存率低的状况并没有明显改变[4-5]。因此，更好地探索CRC发病机制，寻找更敏感、更高效的诊断标志物是CRC领域的一个重要目标[6]。

组织活检是目前诊断肿瘤的金标准，但单个活检提供的肿瘤在空间和时间上的信息是有限的，无法反映肿瘤的异质性，因此需要寻找一种早期诊断、监测CRC发生和发展过程的新型诊断技术。液体活检可以提供所有癌症病变基因图谱(包括原发灶和转移灶)，可作为组织活检的代替或者补充检测手段[7]。外泌体是液体活检的主要靶标之一，并且外泌体具有浓度高、易富集和生物学活性稳定的优势，因此外泌体在临床诊疗应用中具有很好的未来前景。外泌体是由所有细胞产生并存在于所有体液中的小细胞外囊泡[8]，细胞释放多种不同大小的细胞外小泡，包括凋亡小体(1000～5000 nm)、中间微泡(200～1000 nm)和最小的外泌体(30～150 nm)[9]。肿瘤细胞比正常增殖细胞产生和分泌更多的外泌体，并且癌症患者血浆和其他体液中的外泌体水平普遍是升高的[10-11]。因此，外泌体内容物对癌症早期诊断以及治疗可能有着很好的帮助。

本研究通过exoRBase数据库获得CRC患者和正常人血浆样本RNA信息，应用生物信息学方法筛选CRC差异表达的外泌体RNA[包括信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)]表达谱，并构建CRC发生相关的竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)网络，分析与CRC相关的mRNA、lncRNA、circRNA，并对mRNA进行功能富集分析。将CRC患者血浆外泌体中多种功能RNA联合起来进行分析为挖掘出更多新的CRC肿瘤标志物提供了可能性，并且对CRC早发现、早诊断、早治疗有着指导意义，为临床医生治疗决策的选择提供了更多可能性。

1 资料与方法

1.1 资料下载 从exoRBase(http://www.exorbase.org/)下载CRC和正常人血标本外泌体RNA(包括mRNA、lncRNA、circRNA)表达谱，其中CRC患者血标本12例，正常人血标本32例，并对数据进行格式预处理。

1.2 差异表达基因(DEGs)筛选 使用“limma”和“sva”R包来鉴定DEGs。符合|log2FC|>0且P<0.05的RNA被筛选为DEGs(包括DEmRNAs、DElncRNAs、DEcircRNAs)，并绘制相应的火山图。

1.3 微小RNA(miRNA)预测及ceRNA调控网络构建 本研究通过Target Scan Human 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRanda(http://cbio.mskcc.org/microrna_data/miRanda-aug2010.tar.gz)预测mRNA相对应的miRNA；使用ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)对circRNA进行预测得到其miRNA；在miRcode(http://www.mircode.org/)对lncRNA进行预测。最后，将相关mRNA、circRNA、lncRNA和其相对应的miRNA预测数据导入Cytoscape软件中，根据共同靶向miRNA构建miRNA相关的ceRNA调控网络。

1.4 功能富集分析 为了评估在外泌体中差异表达的mRNAs潜在生物学功能，我们用clusterProfiler、enrichplot和ggplot2软件包进行基因本体论(GO)注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。GO富集分析主要包括生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)三组，基于GO数据库进行显著性分析。KEGG富集分析依据 KEGG数据库对差异基因进行通路显著性分析。

1.5 统计学方法 所有的统计分析均在R 3.63统计学软件中完成。计量资料以均数±标准差表示，统计检验采用t检验或方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DEGs筛选结果 共筛选出125个差异表达的mRNAs(DEmRNAs)(上调基因118个，下调基因7个)、53个差异表达的lncRNAs(DElncRNAs)(均为下调基因)和81个差异表达的circRNAs(DEcircRNAs)(其中上调47个，下调34个)。DEGs火山图见图1。

图1 CRC患者与正常人血浆外泌体中三种差异RNAs火山图

2.2 miRNA相关ceRNA调控网络构建 基于CRC差异性表达的mRNA、lncRNA、circRNA及相对应的miRNA预测数据，本研究构建了ceRNA网络，共25个mRNA节点、16个lncRNA节点、13个circRNA节点和62个miRNA节点(图2)。已有研究发现，miR-15b、miR-17等可以辅助诊断CRC[12]；miR-6家族成员可以作为诊断癌症的潜在生物标志物[13]；miR-429失调参与了多种癌症上皮-间质转化、进展、侵袭、转移、凋亡和耐药等过程[14]；miR-218、miR-497可以作为癌症预后标志物[15-16]；miR-135可以作为一种新的消化道肿瘤标志物[17]。

图2 mRNA相关ceRNA调控网络

2.3 Go注释及KEGG通路富集分析 为了进一步检测ceRNA网络中所有差异表达mRNA在CRC中的潜在功能，我们进行了GO和KEGG功能富集分析。GO注释富集分析显示，外泌体mRNA主要富集在高尔基组织、高尔基体网、高尔基池、高尔基顺行池、高尔基堆、核孔、高尔基池膜、富含ficolin-1颗粒腔、黏着斑[18]、细胞基质黏附连接、细胞-基底连接、GTP结合蛋白RAN通路(图3)。KEGG通路富集分析显示，调控网络中差异表达的mRNAs主要富集在志贺菌病、FcγR介导的光细胞增多症、胰高血糖素信号通路、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、多种寿命调节途径、肾细胞癌、沙门氏菌感染[19]、癌症中心碳代谢、胞吞作用、上皮细胞侵袭、胰腺癌通路(图4)。其中，GTP结合蛋白RAN与整体癌症风险相关[20]；MAPK上调是CRC发展过程中的必需环节[21]；VEGF对CRC患者生存率有重要影响[22]；癌症中心碳代谢会在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPKC)协调下促进癌细胞生长[23]。上述结果表明，血浆外泌体中差异表达mRNA在CRC发生与发展中可能起着重要作用。

图3 GO注释富集分析柱状图(A)与气泡图(B)

图4 KEGG通路富集分析柱状图(A)与气泡图(B)

3 讨 论

CRC是我国常见的消化道恶性肿瘤之一[24]，预后与分期密不可分。CRC早期患者5年生存率可达90%，而晚期患者却不到10%，因此早发现、早诊断和早治疗对于CRC患者显得十分重要。目前已经进入精准医学新模式，从分子层面探索和发现CRC新的诊断标志物将有望为CRC的诊断提供新思路和新策略。

外泌体中富含多种生物活性物质，包括核酸、蛋白、脂质等，其中核酸包括miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等[25]，这为我们建立多种RNA联合的ceRNA调控网络提供了很好的数据来源。与传统液体活检所检测的细胞游离核酸相比，外泌体具有浓度高、易富集和生物学活性稳定的优势，因此外泌体在临床诊疗应用中具有很好的未来前景。已有研究发现，外泌体中miRNAs可以成为一种特别有前途的生物标志物候选物。miRNAs在细胞生长、分化、增殖、发育、凋亡和代谢等多种过程中发挥着重要作用[26]，某些miRNA，如miR-21，被发现在实体瘤患者的血浆外泌体中高表达，如胶质母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌[27]，并且miR-21表达水平与疾病的存在、进展和对治疗的反应相关[28-29]。在非小细胞肺癌中，外泌性miRNA与无病生存率和总生存率相关。

ceRNA在包括CRC、前列腺癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、肝癌和乳腺癌等癌症的发生和发展中起着重要作用。各种类型的RNA分子，如mRNA、lncRNA、假基因和circRNA，通过共享共同的miRNA反应元件(MRE)形成一个相互调节的网络。根据ceRNA假说，共享一个或多个MRE的RNA分子可以充当ceRNA；两个RNA共享的MRE越多，它们之间的关系就越密切。ceRNA调控网络的假说为更全面地理解基因调控网络奠定了基础。基因突变、表观遗传修饰和染色体重排经常出现在肿瘤的非编码基因组中，由于mRNA中的3-UTR序列相对较短，MREs相对较小的突变或缺失可改变非编码RNA(ncRNA)的调控和转录后控制，进一步破坏ceRNA网络的平衡。反过来，ceRNA网络的不平衡可能促进肿瘤中多种恶性生物学行为。然而，目前对于CRC ceRNA网络的研究主要集中在lncRNA上，对假基因、circRNA或tRNA的研究相对较少。因此，本研究更全面地发现和整合了CRC ceRNA调控网络，将mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA结合起来构建的调控网络有助于认识CRC发生、发展、诊断和治疗的调控分子机制，为将来CRC的精准医学治疗提供了借鉴和依据。

本研究共筛选出125个mRNAs、53个lncRNAs和81个circRNAs，并与其对应的miRNA预测数据构建ceRNA调控网络，再对ceRNA网络的25个共同差异表达mRNA进行富集分析。GO注释富集分析显示，CRC ceRNA网络中的外泌体mRNA与癌症相关通路主要富集在GTP结合蛋白RAN通路。KEGG通路富集分析显示主要富集于MAPK和VEGF信号通路。

综上所述，本研究确定了CRC发生相关的外泌体RNA并构建了相应的ceRNA网络，为进一步研究CRC转移、进展提供了分子基础，同时为CRC早期诊断提供了新型的液体活检生物学标志物。但是还存在以下不足：外泌体样本量少，需要进一步进行临床多中心验证；缺乏与其他数据库的联合分析；缺乏进一步的基础研究。