野生山樱桃大小孢子发生和雌雄配子体发育过程的研究

杨楠，聂江力，通信作者，辛微，裴毅，石福臣

野生山樱桃大小孢子发生和雌雄配子体发育过程的研究

杨楠1，聂江力1，通信作者，辛微1，裴毅1，石福臣2

（1. 天津农学院 园艺园林学院，天津 300392；2. 南开大学 生命科学学院，天津 300384）

以天津蓟州区发现的野生山樱桃花芽和花蕾为试验材料，采用石蜡切片法对野生山樱桃大小孢子发生、雌雄配子体发育过程和雌雄性细胞发育的对应关系进行了研究。结果表明：野生山樱桃花药为蝶形，有4个药室，花药壁由内而外分别是绒毡层、中层、药室内壁和表皮，四分体为正四面体。大孢子发生过程中，孢原细胞分裂产生造孢细胞，进而分裂形成大孢子母细胞。大孢子母细胞减数分裂成线性排列的四分体，形成4个大孢子，最后只有1 个功能大孢子最终发育成胚囊。部分山樱桃子房中形成双胚珠，其中一个可以发育成成熟胚珠，另一个退化消失。山樱桃雄蕊发育早于雌蕊。

山樱桃；小孢子；大孢子；配子体发育

2018年初在天津市蓟州区八仙山自然保护区内发现十几株野生山樱桃，天然更新状况良好，其中一株树龄达百年，株高达20 m，被取名为“野樱王”。如此长树龄的野生山樱桃在我国北方地区较为罕见，同时也是天津地区首次发现的野生山樱桃植株。目前，对于山樱桃的研究主要集中在引种繁殖、栽培管理、组织培养及种子萌发等方面[5-7]，生殖生物学方面的系统研究则更偏向于蔷薇科和其他樱属植物，关于天津地区野生山樱桃生殖生物学方面的研究笔者未见报道。因此，本研究以天津地区首次发现的野生山樱桃为试验材料，对其大小孢子发生和雌雄配子体发育过程进行观察，旨在了解野生山樱桃生殖过程，以期为天津地区樱属植物的栽培育种和进一步研究开发野生山樱桃种质资源、樱桃水果改良等技术问题积累资料，也为山樱桃其他方面的进一步研究提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

山樱桃（）采集地位于天津市蓟州区八仙山自然保护区。天津八仙山自然保护区地处北温带地区，属于暖温带季风性大陆气候，气候温湿，光照充足，夏季多雨，年平均降雨量约9 568 mm，年平均气温8～10 ℃，7月份平均气温23.4 ℃，海拔1 000 m左右。

1.2 试验材料采集

于2019年4月初花芽露出花瓣开始，每天采集5个开放程度一致的花蕾，直至花瓣凋谢，采集的花蕾去掉花瓣和花萼，用FAA固定液（38%甲醛：冰醋酸：70%酒精＝5∶5∶90）固定，在4 ℃冰箱中保存。

1.3 试验方法

采集的试验材料用FAA固定24 h后，将材料依次放入50 %和70 %乙醇浸泡3 h，将材料放置在爱氏苏木精稀释染液中整染3 d。整染后取出材料用蒸馏水漂洗至不再出现蓝紫色后，依次用30%、50%、70%、85%、95%以及100%乙醇分别浸泡3 h进行脱水，其中100%乙醇浸泡2次。脱水后的材料仍然放置于100%乙醇中，用1/5二甲苯（吸出瓶内1/5试剂，再加入1/5二甲苯）、2/5二甲苯、3/5二甲苯、4/5二甲苯和纯二甲苯（2次）依次浸泡3 h，对材料进行透明处理。处理好的材料放置于纯二甲苯溶液中，加入碎蜡（36 ℃培养箱中），注意少量多次并放置过夜。

第2天取出用二甲苯和石蜡充分浸泡的材料依次用50%石蜡（40～42 ℃恒温箱）和70%石蜡（48～50 ℃恒温箱）浸泡1 h，纯石蜡（58 ℃恒温箱，3次）浸泡30 min。将经过纯石蜡浸泡的材料进行包埋，并在蜡块凝固后将其修整成为适宜大小的正方体并用LEICA RM2265切片机进行切片，切片厚度设定为8～9 μm。切片完成后取完整清晰的蜡带用粘片剂粘在载玻片上，放置展片台上展开后于36 ℃烘箱中烘干。烘干后用纯二甲苯和1/2二甲苯浸泡，然后将100%、95%、85%、70%、50%、30%乙醇依次滴在载玻片上停留5 s，用番红固绿染色并用树胶封片。在Leica-DM4000显微镜下观察目的细胞并拍照。

2 结果与分析

2.1 小孢子发生和雄配子体发育

2.1.1 小孢子发生

山樱桃花芽分化结束后，花芽内细胞持续分裂并分化出各个花器官。雄蕊原基进行伸长生长，同时顶部膨大形成花药和花丝，花药表皮下分化出体积较大、近圆形的孢原细胞，孢原细胞经过平周分裂产生两类细胞，一类为外侧的初生周缘细胞，最终分裂形成花药壁，另一类则为初生造孢细胞。随着发育的进行，初生造孢细胞通过不断有丝分裂形成圆形、细胞核明显的次生造孢细胞（图1-1），次生造孢细胞继续分裂发育形成圆形的小孢子母细胞。观察石蜡切片发现，小孢子母细胞形状饱满，细胞中可见明显细胞核且具有浓密的细胞质（图1-2）。小孢子母细胞经过两次减数分裂产生四面体型四分体（图1-3，图1-4）。在这一过程中，小孢子母细胞一直包裹在浓厚的胼胝质中。减数第一次分裂中，小孢子母细胞经过减数分裂前期、中期、后期和末期，分裂成二分体。此时没有产生新的细胞壁，胞质不分离，细胞中有两个细胞核。完成第一次减数分裂后，二分体经历短暂的分裂间隔后进入第二次减数分裂。二分体在第二次减数分裂前期中，染色体由起初散乱地分布在细胞中变为聚集并且螺旋化，核仁核膜消失，细胞中出现纺锤丝。此时细胞分裂进入第二次减数分裂中期，赤道板上排列着着丝点（图1-5，图1-6）。在纺锤丝的牵引下，染色体自中期的赤道面向两极移动，细胞分裂进入第二次减数分裂后期（图1-6）。最后，核膜核仁重现，染色体到达两极，此时为第二次减数分裂末期（图1-7）。最终，减数分裂结束，将一个小孢子母细胞分裂成为含有相同遗传物质的4个由胼胝质壁包裹在一起的细胞，即四分体。山樱桃小孢子四分体为四面体型（图1-4）。通过观察切片可以发现，山樱桃同一药室中的小孢子母细胞减数分裂基本同步。但同一花药的不同药室不同步，相差大约2～3个分裂时期（图1-8）。

2.1.2 雄配子体发育

我再去青木那儿的时候他还是那样的笑，似乎什么事都没有发生。对啊，他这个年龄的男人，应该是处变不惊的。他没有提起上次，这是怎样的态度，我搞不懂。

小孢子母细胞经过减数分裂形成四分体，包裹在胼胝质中，部分小孢子出现液泡化（图1-9）。减数分裂完成后，胼胝质壁消失，释放出小孢子，观察发现刚从胼胝质中释放出来的小孢子细胞壁出现褶皱（图1-10）。从胼胝质中释放出来的小孢子经过发育形成浓厚的细胞质，细胞核位于细胞中央，体积较大，十分明显（图1-11），为单核小孢子。单核小孢子体积逐渐增大使细胞壁变为平整状态，形状接近球形，细胞内出现液泡，随着液泡体积的增加，逐渐推动细胞核向靠近细胞壁的方向移动，能观察到明显的细胞核。单细胞核靠边的小孢子开始进行有丝分裂，经过有丝分裂前期、中期、后期和末期，分裂形成两个不均等的细胞核（图1-12），贴近细胞壁的细胞核发育成生殖细胞，体积较小，另一个发育成为营养细胞，体积远大于生殖细胞。随后生殖细胞的液泡开始缩小，并进行有丝分裂产生两个精细胞。

2.1.3 花药壁发育

野生山樱桃为两性花，成熟花药为蝶形，有四个花粉囊（图1-13）。起初，花药的横切面为近圆形，细胞排列紧密（图1-14）。花药四角的细胞首先开始快速分化形成孢原细胞，在表皮细胞内侧将花药分割成四部分，孢原细胞继续分化产生两类细胞，内层的初生造孢细胞分裂产生次生造孢细胞，外侧的初生周缘细胞进行平周分裂和垂周分裂，与最外层的表皮细胞一起形成花药壁的四部分，由内向外分别为绒毡层、中层（两层），药室内壁（纤维层）和表皮共五层细胞（图1-15）。

在花粉粒发育成熟中，花药壁的四种组成细胞也会随之产生相应变化。在孢原细胞分化出小孢子母细胞的过程中，花药壁分化出了绒毡层、中层，药室内壁和表皮四种细胞，此时四种细胞基本呈现长方形，排列整齐紧密，胞质透明，在药室最外层的表皮细胞相较于其他三种细胞体积较大，呈长方形或接近正方形，细胞紧密排列；紧贴着表皮细胞内侧排列的药室内壁细胞性状偏向正方形或椭圆形，内含液泡；药室内壁内层为中层，花药壁中形成的中层细胞有两层，细胞形状为扁长形，细胞结构不明显；最内层为绒毡层细胞，形状为细长形。随着小孢子母细胞减数分裂产生小孢子，进而形成成熟的花粉粒，表皮细胞液泡化，发生横向伸长，形状由长方形变为扁长形（图1-16），并随着花粉发育成熟而逐渐分解。药室内壁出现纤维性增厚，最终转化成为纤维层，中层细胞也随着小孢子的发育逐渐变为扁长型，体积收缩，最终解离消失。当小孢子母细胞分化成小孢子后，绒毡层细胞分解，为花粉发育成熟提供营养物质，小孢子发育成成熟的花粉粒时，中层和绒毡层分解消失，只剩下纤维状增厚的药室内壁和分解过后的表皮细胞残留（图1-17）。最后花药室开裂，释放出成熟的花粉粒（图1-18）。

注：1. 次生造孢细胞；2. 小孢子母细胞；3. 四分体；4. 四面体型四分体；5、6、7. 小孢子减数分裂过程；8. 不同药室内小孢子处于不同发育时期；9. 小孢子液泡化；10. 细胞膜皱缩的小孢子；11. 单核小孢子；12. 小孢子细胞核分裂成营养细胞核和生殖细胞核；13. 有四个药室的成熟花药；14. 初生圆形花药；15. 有五层细胞的花药壁；16. 花药壁表皮细胞伸长；17. 残留的药室内壁和表皮细胞残留物；18. 只剩下纤维层的细胞壁开裂释放出成熟花粉粒

2.2 大孢子发生和雌配子体发育

2.2.1 大孢子发生

野生山樱桃的雌蕊原基分化完成后，雌蕊原基继续进行细胞分裂，逐渐分化出柱头、花柱和底部膨大的子房结构，雌蕊原基底部表皮下的细胞分化成胚珠原基，随着胚珠原基的分化发育，原基顶端分化出一个体积明显大于其他细胞、细胞核明显的孢原细胞。孢原细胞分裂发育成形状饱满、体积较大的初生周缘细胞和初生造孢细胞。初生造孢细胞进一步分裂发育形成大孢子母细胞（图2-1），周缘细胞经过发育形成珠心原基，进而经过平周分裂和垂周分裂形成几层珠心细胞包裹着大孢子母细胞。同时随着孢原细胞的发育，在珠心基部的细胞分裂快，形成指状突起，随着大孢子母细胞的发育逐渐向顶端生长扩展，最后发育成为珠被（图2-2）。

大孢子母细胞开始第一次胞质分裂产生二分体，形成二分体后直接开始第二次分裂，形成四分体，此时发育较慢的内珠被逐渐被外珠被包围，仅在顶端形成一个小孔，即珠孔。由于胚珠基部的不均衡生长，在大孢子母细胞形成时，胚珠变成为倒生胚珠（图2-3）。随着四分体的发育，有三个大孢子逐渐退化消失，只有一个大孢子能够继续发育成功能大孢子（图2-4）。

2.2.2 雌配子体发育

功能大孢子继续发育，细胞中出现液泡，细胞核明显处于细胞中央，此时功能大孢子发育成单核胚囊。随后单核胚囊中细胞质变浓，液泡体积逐渐增加，并占据细胞的大部分体积，胚囊中的细胞核进行减数分裂，产生两个细胞核（图2-5）。这两个细胞核各自向胚囊两端的珠孔端和合点端移动，液泡处于胚囊中央。之后移动到胚囊两端的细胞核继续分裂，进而发育成四核胚囊（图2-6）。四核胚囊第三次减数分裂产生八个细胞核，最终形成八核胚囊（图2-7）。此时八个细胞核，四个位于珠孔端，另外四个位于合点端，在这个过程中胞质不分裂。在单核胚囊分裂成八核胚囊的过程中，胚囊细胞显著伸长，胚囊中八个细胞核继续分化。珠孔端、合点端两个方向各自有一个细胞核向胚囊中央发生移动并最终发育为互相靠近的两个极核。在随后的发育过程中，近珠孔端的其他三个核分化成为卵器（图2-8），一个分化成卵细胞，另两个分化成助细胞。近合点端的另外三个核则发育成反足细胞。此时，单核胚囊就发育成七细胞八细胞核的成熟胚囊。由此可知，野生山樱桃胚囊的发育类型为蓼型。

注：1. 大孢子母细胞；2. 珠被细胞；3. 倒生胚珠（珠孔）；4. 功能大孢子；5. 二核胚囊；6. 四核胚囊；7. 八核胚囊；8. 卵器细胞

2.3 野生山樱桃的双胚珠现象

野生山樱桃的子房为单心皮，观察切片发现部分切片中，子房内出现两个胚珠，具有珠心珠被等结构（图3-1）。胚囊发育初期（图3-2），部分切片中两个胚珠发育程度一致，且都发育正常（图3-1）；还有一部分切片中两个胚珠发育情况不同，一个能够正常发育，另一个出现畸形的现象（图3-3）。但在单核胚囊减数分裂形成八核胚囊的过程中，其中一个胚珠能够正常发育，另一个胚珠开始逐渐萎缩，并逐渐停止发育（图3-4）。正常发育的胚囊能够接受受精，形成合子并继续正常发育，另一个异常发育的胚珠不能受精，逐渐退化（图3-5）。此外，少数大孢子发育的石蜡切片中出现两个胚珠均不能正常发育（图3-6）。成熟的山樱桃种子中只有一个种子，切片中没有发现胚珠发育后期两个胚珠同时正常发育，且没有两个胚珠共同发育成果实的现象。

注：1. 具有正常结构的两个胚珠；2. 双胚珠发育初期；3. 一个胚珠正常发育，另一个胚珠发育畸形；4. 两个胚珠发育阶段不同，其中一个停止发育；5. 受精作用后，不能受精的胚珠逐渐退化消失；6. 两个胚珠均不能正常发育

2.4 野生山樱桃雌雄配子体发育过程的对应关系

如表1所示，野生山樱桃在生长发育进程中，其外部状态改变主要体现在花芽膨胀变大、芽鳞片展开露出绿色、花冠显露、花朵盛开等，总共经历35 d左右。对比其雌雄蕊发育过程，发现雄蕊发育较早，而雌蕊发育相对迟缓。当雄蕊花粉发育为三细胞花粉时，雌蕊仍处于单核胚囊时期。

表1 雌雄蕊发育过程中的对应关系

3 讨论

3.1 野生山樱桃的小孢子皱缩现象

不同种被子植物的大小孢子发生和雌雄配子体发育过程大体相似，同时也各自保留一些该种植物独有的发育特征[8]。植物花粉的发育从小孢子母细胞减数分裂开始，到花药开裂释放出成熟花粉结束，在这一过程中出现任何异常现象都有可能导致最终产生花粉不育[9]。观察石蜡切片发现，野生山樱桃小孢子发育过程中出现了细胞质膜皱缩的异常现象，小孢子刚完成减数分裂产生四分体时形状饱满，经过一段时间后，开始出现细胞皱缩空瘪。在被子植物中，出现这种现象的原因可能是由于外界环境变化或自身遗传机制导致，主要表现为绒毡层结构和功能异常，不能正常提供营养物质、小孢子发生过程异常和减数分裂结束后花粉发育不正常等方面[10]。李志军等[11]观察软枣猕猴桃小孢子发育过程，发现软枣猕猴桃的小孢子也出现了这种细胞质凝集导致的小孢子空瘪现象，COIMBRA等[12]认为这可能是由于细胞的程序性死亡而导致。袁娟[13]研究大花紫薇生殖生物学特性时，发现大花紫薇有极少数小孢子出现皱缩现象，但整个发育过程中小孢子正常发育，并且没有对之后的花粉形成产生影响，这可能是大花紫薇自身的遗传机制造成的。谭金桂等[14]观察焕镛木小孢子发育过程，也发现小孢子皱缩现象，同时随着细胞液泡化，这种现象会逐渐消失。在本研究中，没有发现小孢子皱缩会对山樱桃小孢子的后续发育造成不良影响，推测这种现象有利于小孢子有丝分裂成生殖细胞和营养细胞这一过程的进行[14]。

3.2 野生山樱桃小孢子发育不同步现象

对野生山樱桃小孢子母细胞观察发现，在小孢子母细胞减数分裂过程中，同一药室内减数分裂基本同步，但同一花药的不同药室不同步，同一花粉中既有二分体也有四分体。在自然界中有很多植物在小孢子母细胞减数分裂过程中都会出现此类现象，石艳兰等[15]研究二倍体芒时发现了这种花粉粒发育不同步现象，并认为这可能是导致其小孢子败育的关键原因。有研究认为，在植物生长过程中发生这种现象，可能与小孢子母细胞胞间的连丝数量，绒毡层发育程度、胼胝质壁的形成以及自身遗传机制有关[16]。

3.3 野生山樱桃大孢子的双胚珠现象

在野生山樱桃大孢子发育过程中，通过石蜡切片可以观察到，在发育初期，有部分子房中存在两个胚珠，在发育过程中，两个胚珠均能形成珠心和珠被，到发育后期时，其中一个胚珠开始退化败育并逐渐解体，最终只能收获一个种子，这可能由于子房中两个胚珠竞争营养成分或授粉时未能接受到足够的花粉[17-18]，同时也可能与其本身的遗传因素有关。在蔷薇科植物月季中也出现了双胚珠现象，孙宪芝[19]认为月季原本可能具有多个胚珠，但这些胚珠在自然进化的过程中逐渐退化，演变成现在的一个子房中含有单个胚珠，而个别子房有两个胚珠同时分化可能是一种“返祖”现象。

4 结论

花芽内形成雌蕊原基后继续分化产生胚珠原基和小孢子母细胞，小孢子母细胞继续进行减数分裂产生四分体，正四面体的四分体继续有丝分裂最终形成花粉。山樱桃花药为蝶形，有四个药室，花药壁有四层，由内而外分别是绒毡层、中层、药室内壁和表皮。在花粉发育过程中，绒毡层为小孢子发育提供营养物质，随着发育的进行逐渐分解。花粉发育成熟时，绒毡层和中层消失，药室内壁发生纤维性增厚。

野生山樱桃大孢子发生过程中，孢原细胞分裂产生造孢细胞，造孢细胞进一步分裂形成大孢子母细胞。大孢子母细胞减数分裂成线性排列的四分体，形成四个大孢子，最后只有一个功能大孢子最终发育成胚囊。部分山樱桃子房中形成双胚珠，其中一个可以发育成成熟胚珠，另一个退化消失。野生山樱桃雄蕊发育早于雌蕊，且在本试验中没有发现雌蕊发育过程中出现异常现象。因此，导致野生山樱桃自然结实率较低的原因，可能是小孢子的皱缩和花粉粒发育不同步现象。

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Studies on the development of microspores and male and female gametophytes in wild

Yang Nan1, Nie Jiangli1,Corresponding Author, Xin Wei1, Pei Yi1, Shi Fuchen2

（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. College of life science, Nankai University, Tianjin 300384, China）

In this experiment,buds found in Jizhou district of Tianjin were used as experimental materials. The genesis of megaspore and microspore, the development of its gametophytes and the interrelationship between female and male cell development ofwere studied by paraffin sectionThe results showed thatanthers were butterfly-shaped with 4 drug Chambers. The anther walls were tapetum, middle layer, chamber wall and epidermis from inside to outside. The tetrad was a regular tetrahedron. During megaspore generation, sporogenic cells divided to produce sporogenic cells, which then divided to form megaspore mother cells. Megaspore mother cells meiosis into linear arrangement of the tetrad formed four megaspores, but finally only one function megaspore eventually developed into the embryo sac. In some of the ovary, there weretwo ovules, one of which could mature into embryo sac while the other degenerated and disappeared. The stamens ofdeveloped earlier than the pistil.

; microspore; megaspore; gametophytic development

S662.5

A

1008-5394（2021）02-0018-07

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.004

2020-05-06

天津市科技计划项目（18ZXZYNC00120；16PTZSTG00020）

杨楠（1996—），女，硕士在读，主要从事植物资源开发与利用。E-mail：ynbalabala@163.com。

聂江力（1972—），女，教授，博士，主要从事植物资源开发与利用。E-mail：njlnie@126.com。

责任编辑：杨霞