拟南芥LHY基因超表达与成花转变

尹晟，傅钰，龙鸿

拟南芥基因超表达与成花转变

尹晟，傅钰，龙鸿通信作者

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300392）

高等植物的成花转变受到多个基因网络的调控，植物从营养生长转变为生殖生长，与植物自身发育的生物节律相关，然而生物钟（circadian clock）相关基因在其中的调控作用仍不清楚。本研究通过构建超表达载体pCAMBIA-3301 -遗传转化后获得超表达植株，分析超表达生物节律基因对成花转变的影响。结果表明，超表达植株具有18片莲座叶，野生型植株为12片；超表达植株在第33天出现可见花芽，野生型植株则为20 d，超表达植株表现出晚花表型。茎端分生组织解剖结构分析表明，超表达植株在第19天（野生型植株15 d）时生长锥持续生长发育，凸起明显增高，具多层原套细胞，原体和髓分生组织细胞分裂，数量增多，说明超表达植株营养生长成熟期延迟，导致晚花。qRT-PCR对及其靶基因表达水平检测结果表明，超表达植株的表达量随植物发育进程逐渐降低，而表达量则逐渐升高，超表达植株可能通过调控和的表达量来调控成花转变。

拟南芥；成花转变；基因；超表达

高等植物开花是由内部基因和外界环境共同作用来完成。这个调节过程涉及错综复杂的信号通路。拟南芥作为研究植物开花调控途径的模式植物，它对环境条件比较敏感并且适于利用遗传学技术对其开花机制展开研究，目前对控制其开花时间尤其开花信号通路研究方面取得了很大进展。环境因子是多种开花调控网络的组成部分，遗传和分子生物学研究鉴定出4条调控植物开花的主要途径：光周期途径、自主开花途径、春化途径和赤霉素（GA）途径[1-5]。

植物在长期进化过程中，形成了随着外界昼夜循环同步变化的内在控制时长的生物学机制-生物节律钟（circadian clocks），调控气孔开闭、生长、光周期等生理过程[6]。光周期途径中的核心调控蛋白CONSTANS（CO）与数个信号系统相连，如生物节律钟和光信号的光受体[5]，光信号则与内源生物节律钟相关[7-8]。植物体内生物节律钟由四种不同但相关联的调控组分组成。（1）早晨组分（morning complex），（2）中午组分（middle complex），（3）晚上组分（evening complex），（4）夜间组分（night complex）[9-12]。早晨时2种早晨组分（）和（）得到富集，并直接抑制其他三种组分的基因表达[13-14]。随着一天中时间的推移，早晨组分受到其他三种组分的抑制并表现出随时间渐次替代的特点[15-16]。

开花是果树生产的重要环节，调控果树开花在生产实践中具有重要意义。研究表明，小分子RNA（miRNAs）参与了成花转变调控[17-20]。作为植物体内生物节律钟早晨组分之一，在一天内调控表达，但它在成花转变中的作用未知，尤其是与时间依赖的小RNA开花调控途径的互作仍不清楚。本试验通过构建超表达载体pCAMBIA- 3301-经遗传转化后得到拟南芥超表达植株，研究超表达植株中的成花转变过程，并探讨及其靶基因在此过程中的作用，为基因与成花转变之间的关联提供试验依据，并可为果树开花调控提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥（L.）野生型Col-0种子由天津农学院果树学重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 植株种植

方法参见文献[21]。将拟南芥种子浸湿后置于培养皿中4 ℃春化3 d。点种到蛭石∶营养土＝1∶1的培养土中，人工气候室培养。16 h光照/8 h黑暗，光照强度180 μmol/（m2·s），温度20～22 ℃，湿度为60%～80%。

1.2.2基因超表达载体的构建

从TAIR数据库中查找基因的序列信息，利用primer软件辅助进行特异性引物的设计，引物序列5＇-GCCATGGATACTAATACATCTGGA- 3＇，5＇-GGTCACCTCATGTAGAAGCTTC TC-3＇，扩增部分包含编码区。采用CTAB法提取植株叶片组织的总RNA；RT-PCR扩增后获得基因的全长基因序列，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的基因进行回收；使用试剂盒提取质粒；对-T1-使用I和O65 I进行双酶切，将载体原有GUS基因切除，将目的基因插入该处与pCAMBIA-3301表达载体相连接，使用载体上原有基因的CaMV 35s启动子和NOS终止子，获得pCAMBIA-3301超表达载体。

1.2.3 获取并检测转基因植株

获得pCAMBIA-3301-超表达载体后，电击转化以获得含重组质粒的农杆菌，对拟南芥（Col-0）花序使用浸花法进行侵染，用抗性（除草剂Basta）进行转基因阳性植株的筛选，筛选到T3代后获得含有基因的转基因阳性纯合植株，并对转基因植株进行抗性基因鉴定。

1.2.4 拟南芥形态学观察

待野生型对照和超表达T3代植株的种子长出子叶后，开始观察记录野生型Col-0及超表达植株的形态学特征，方法参见文献[21]。

1.2.5 石蜡切片的制作

方法参见文献[21]。FAA固定液固定不同生长时期的拟南芥顶端分生组织，爱氏苏木精整染 2 d，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，用LEICA RM2235切片机切片，切片厚度8 μm，在Olympus BX53显微镜下观察，Spot Idea CCD相机拍照。

1.2.6 荧光实时定量PCR

以为内参基因，通过荧光实时定量PCR进行检测不同时期植株中及靶基因的表达量变化，方法参见文献[21]。引物序列：Actin-2-F，5＇-GCTGAGAGATTCAGATGCCCA-3＇，Actin-2-R，5＇-GTGGATTCCAGCAGCTTCCATACT-3＇，miR156-F，5＇-CATCTTGTAGATCTCTGA AGT TGGACT-3＇，-R，5＇-GAGATTGAGAC ATAGAGAACGAAGACA-3＇，-F，5＇-TGAG AAGAAGCAAAGCGGAA-3＇，-R，5＇-TAT CCGCGG TACAACTCTCG-3＇。

2 结果与分析

2.1 LHY基因超表达突变体的构建及验证

以拟南芥Col-0野生型总RNA反转录产物cDNA为模板，PCR扩增大小约1 900 bp的基因全长，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示：扩增出的PCR产物与目的基因的片段大小一致，说明利用RT-PCR已将基因成功扩增（图1）。将扩增得到的基因导入到超表达载体，随后将筛选得到的阳性重组质粒转入农杆菌中。用农杆菌浸花法转化拟南芥，经Basta筛选获得T3代纯合的超表达转基因株系用于后续试验。采用半定量RT-PCR方法鉴定野生型及转基因植株的基因，T1、T2、T3代均能扩增出405 bp的基因，说明基因在转基因植株中可以表达（图2）。

注：M：2 000 bp Marker；A：RNA；B：基因PCR产物

注：A，B，C分别为T1、T2、T3代，M：2 000 bp Marker；1：对照组 PCR；2～6：转基因植株 PCR

2.2 超表达植株生长周期

为研究超表达植株生长周期，观察并记录莲座叶总数。通过对野生型及超表达植株的生长观察发现，野生型共12片莲座叶（图3-A），超表达植株共18片莲座叶（图3-B）。

进一步观察、统计、分析表明，野生型植株营养生长时间为20 d，之后完成从营养生长到开花的成花转变；超表达植株的营养生长时间为33 d（表1）。这些结果表明：超表达植株产生的叶片数量多，营养生长时间长，比野生型成花转变延迟。

注：A．野生型植株叶片；B. 超表达植株叶片。标尺＝1 cm

表1 野生型及超表达植株莲座叶发育状况比较

注：营养生长时间指从播种日期到植株出现可见花芽的时间。与野生型对比，用检验法对统计结果进行差异显著性分析，**代表极显著差异（≤0.01）

2.3 茎端分生组织结构特征

为更好地分析植株成花转变过程，以野生型和超表达植株茎端分生组织为材料制作石蜡切片，对茎端分生组织解剖结构进行观察。野生型生长到第5天时，茎顶端分生组织生长锥呈平坦状（图4a），第8天时，生长锥略有凸起，细胞为单层（图4b），第10天时，茎顶端分生组织略有升高（图4c），第13天时，茎顶端分生组织细胞增多，同时具有单层和多层细胞（图4d），第15天时，生长锥持续生长发育，凸起明显增高，具多层原套细胞，原体和髓分生组织细胞分裂，数量增多（图4e），但均发育为叶原基，直到第20天时，花芽出现，分化出萼片原基、花瓣原基，而雄蕊原基、雌蕊原基略见雏形（图4f）；超表达植株第5天茎端分生组织生长锥为平坦状（图4g），第8、10、13、15天（图4h～图4k）茎端分生组织生长锥均开始出现凸起，且随植物生长，凸起逐渐增高，细胞开始分裂，数目逐渐增多，茎端分生组织生长锥的凸起程度相比于野生型均较低，说明超表达植株营养生长缓慢，直至第19天（图4I）时，茎端分生组织生长锥明显凸起，出现多层细胞，此时开始进入营养生长成熟期，仍然发育为叶原基，对比此时的野生型植株则花原基发育，开始出现花芽，此后继续发育直至第33天出现明显花芽（图4m）。根据野生型及超表达植株的茎端分生组织生长发育情况对比发现，超表达植株成花转变延迟。

注：A～M为a～m切片取材时对应的植株生长状况

2.4 miR156及SPL3表达分析

随着植株的生长发育，野生型及超表达植株中各个发育阶段的表达量均出现下降趋势（图5）。野生型在第15天时表达量显著下降，第19天时继续下降，至第23天时，下降至更低水平，其后第25、30、33天，的表达量检测不出。超表达植株中表达量在第8、10、13、15天也呈逐渐下降趋势，但下降幅度不大，第19天时表达量明显下降一倍左右，在随后23、25、30 d继续下降，至33 d出现花芽时达极低水平。超表达植株各时期表达量均比野生型高。

注：小写字母表示在5%水平的显著性。下同

同时，检测野生型和超表达植株各生长发育中的的表达量。结果表明，各植株的表达量均呈现上升趋势（图6）。野生型在第8、10、13天时表达量逐渐上升，第15天时上升近3倍，后继续上升至第23天达最大值。超表达植株在第8、10、13、15天依次上升，19 d时表达量上升2倍左右，随后持续上升直至超表达植株生长到第33天时出现花芽，此时表达量处于最大值。超表达植株各时期表达量均比野生型低。

3 讨论

成花转变是重要的农业生产目标，其调控机制可以广泛用于园艺作物遗传改良，如缩短果树童期以促进实生苗尽早开花坐果，反季促成栽培调控蔬菜上市时间，控制花卉花期以适应市场需求，都具有重要的生产实践价值，因此，成花转变的分子调控机制受到广泛关注。

光周期途径是四条主要开花途径之一，植物通过光周期途径感受季节性变化，由一天之中的日照长度（日长）变化来调控许多植物的开花[5]。光信号与植物内源生物节律钟相联 系[7-8]。光受体感应的光信号传导进生物节律钟系统，调解拟南芥的成花转变[22-23]。但是生物节律钟调控基因在成花转变过程中的具体作用仍不清楚。

本研究通过观察野生型及超表达植株的形态学变化，发现超表达植株比野生型植株莲座叶叶片总数多，说明超表达植株营养生长发育缓慢，植株营养体的叶片数量与成花转变之间存在直接联系。此外，野生型植株在第20天出现抽薹，而超表达植株在第33天时才出现抽薹，说明与野生型相比，超表达植株生长速率缓慢。超表达导致植株产生晚花表型。

植株器官形态上的变化与顶端分生组织的发育情况相关。本研究通过石蜡切片观察茎端分生组织生长锥的发育过程，对比野生型，发现超表达植株茎端分生组织生长、发育、分化为叶原基的时间较长，花原基分化明显晚于野生型，推测因为基因的过量表达导致其茎端分生组织发育较晚使其成花转变延迟。从解剖结构细胞特点分析，超表达植株茎端分生组织的生长锥分化较迟，原套、原体和髓分生组织形成多细胞层较晚，致使营养生长时间增长，成花转变延迟。

随着植株生长发育，野生型及超表达植株中表达水平均出现下降趋势，而其靶基因的表达量则升高。是具有时间依赖的开花途径调控功能的小RNA之一[24]，与基因家族一起参与调控植物开花进程[25]。本研究中，野生型及超表达植株中各个发育阶段和的表达量均分别呈现下降和上升趋势，野生型至成花转变时，超表达植株中表达维持较高，表达则较低，说明超表达植株可能通过调控和的表达量来调控成花转变。

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The floral transition ofoverexpression plants in

Yin Sheng, Fu Yu, Long HongCorresponding Author

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

The floral transition in higher plants is regulated by multiple gene network. The transition of plants from vegetative growth to reproductive growth is related to the biological rhythm of plant development. However, the regulatory role of circadian clock-related genes in it is still unclear. By constructing the overexpression vector pCAMBIA-3301-35S::, and the following genetic transformation, the effects of overexpression of circadian clock-related geneon floral transition were analyzed with overexpression plants. The results showed thatoverexpression plants had 18 rosette leaves, while only 12 existed in wild-type plants.overexpression plants had visible flower buds on 33rd day, while wild-type plants were on the 20th day. The overexpressed plants showed late flower phenotype. The anatomical structure analysis of the shoot apical meristem showed that the growth cone ofoverexpression plants continued to grow and develop to a prominent height on the 19th day (compared to 15thday in wild-type plants), with multiple layers of tunica, corpus and pith meristem zone cells. These indicated that overexpression plants had delayed vegetative growth and maturity, leading to late flowering. The results of qRT-PCR on the expression level ofand its target geneshowed thatoverexpression plants regulated the floral transition by down-regulating and up-regulating the expression levels ofandduring plant growth.

; floral transition;gene; overexpression

Q756

A

1008-5394（2021）02-0025-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.005

2020-04-26

天津农学院研究生培养质量提升项目（101018）

尹晟（1994—），男，硕士在读，从事果树遗传方面的研究。E-mail：554182342@qq.com。

龙鸿（1964—），男，教授，博士，主要从事果树遗传、发育生物学研究。E-mail：longhong@tjau.edu.cn。

责任编辑：杨霞