肝细胞癌人源异种移植模型应用研究进展

李晓娟，冯 帆，李瑞生，貌盼勇

肝细胞癌是我国乃至全世界最常见的高发恶性肿瘤之一，发病率位居我国恶性肿瘤第三位，病死率高居第二位[1-3]。另外，我国是乙型肝炎高发国家，因此造成肝细胞癌发病率居高不下[4-5]。肝细胞癌的早期诊断普及程度低，多数患者确诊时已为晚期[6]，失去了手术的机会，即使进行了手术治疗，术后复发率也较高[7]。因此，建立能够模拟临床特征的肝细胞癌动物模型，对于肝细胞癌的发生机制、早期诊断、早期干预治疗及新型治疗方法评估等方面的研究具有重要的意义[8]。

目前研究肝细胞癌常用的实验动物模型包括细胞系肿瘤（cell line-derived xenografts, CDX）模型、人源异种移植（patient-derived xenograft,PDX）模型和遗传工程小鼠模型（geneticallyengineered mouse models, GEMM）等。PDX模型是将取自临床患者的新鲜肿瘤组织直接异种移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的动物模型[9]。相较于其他类型动物模型，PDX模型更大程度地保留了人类原发肿瘤的结构、细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等）以及细胞外基质，能够更好地反映肿瘤细胞与正常细胞及周围基质之间的密切联系和相互作用，在模拟人体肿瘤组织的血管生成、发生发展甚至转移等方面具有明显的优势[10-11]。同时PDX模型不仅能够保留原代肿瘤的遗传学特征（如原始癌症的表型和分子特征），也可作为筛选抗癌药物、评价药物的临床疗效及不良反应很好的工具[12]，还能准确反映人类肿瘤间和肿瘤内的异质性[13]，在药物有效性研究、临床预后预测等方面优势明显[14]。PDX模型还能够保留不同患者原代肿瘤的特性并对原代肿瘤进行传代，可作为肿瘤个性化治疗的研究标本[15]。因此，肝细胞癌PDX模型在药物和生物标志物筛选及联合临床试验中显示出作为临床前模型的优势。

PDX模型构建的成功率与很多因素有关，如肿瘤的类型和恶性程度、受体动物类型、移植方法和部位等[12]。本文对肝细胞癌PDX模型构建中所需实验动物的类型、移植部位和方法、移植手术的影响因素以及PDX模型在肝细胞癌研究应用中的最新进展进行综述。

1 肝细胞癌PDX模型实验动物的选择

PDX模型是不同物种之间的移植类型，必须选用具有免疫缺陷的小鼠。

1.1 裸小鼠 裸小鼠的主要特征是缺乏成熟的T淋巴细胞，而B淋巴细胞正常，但功能不完善。最常用的品系为BALB/c裸小鼠。裸小鼠幼年时NK细胞活性低下，成年后NK细胞会恢复至略高于正常小鼠，同时T淋巴细胞也会增加，这些恢复的NK细胞、巨噬细胞以及抗原提呈细胞等使裸小鼠的移植排斥作用也随之增加[16]。因此一般选用4～6周龄裸小鼠。在移植肿瘤实验操作中，无须对裸小鼠进行前处理，成功率较高，移植传代后的肿瘤组织能够很好地保留其原有的特性。

1.2 重度联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）小鼠 SCID小鼠被毛正常，T、B淋巴细胞均缺失，异种移植肿瘤组织的成功率明显高于裸小鼠。在SCID小鼠体内能够观察到较高的肿瘤转移率，因此可作为研究肿瘤生长转移和免疫治疗的良好模型[17]。SCID小鼠的T、B淋巴细胞的免疫功能也会随着周龄的增加部分恢复[18]。研究者为保证移植成功率，首次移植可以先选择SCID小鼠，而在后续移植传代中为了延长观察时间和节省研究经费选用裸小鼠[19]。

1.3 NOD/SCID小鼠 NOD/SCID小鼠是由NOD/Lt小鼠（胰岛素依赖性糖尿病小鼠）和SCID小鼠杂交获得，该小鼠T、B淋巴细胞缺陷，NK细胞活性很低，巨噬细胞和抗原提呈细胞的功能也受到损害。由于其免疫缺陷程度高，不易发生免疫逃逸，因此其异种移植成功率显著高于SCID小鼠，是目前公认异种移植肿瘤动物模型理想的选择之一。但该小鼠的寿命较短，不建议进行实验周期较长的研究。

1.4 NOG小鼠 NOG小鼠是由NOD/SCID小鼠与IL-2γnullKO小鼠杂交而获得，缺乏T、B淋巴细胞和NK细胞，树突状细胞和巨噬细胞功能减退，补体活性缺乏，其免疫功能严重不全，因此异种移植成功率显著高于NOD/SCID小鼠，也是公认的异种移植模型理想的选择之一，广泛应用于免疫系统、造血系统和肿瘤方面的研究领域[20]。

1.5 B-NSG小鼠 B-NSG小鼠是利用基因编辑技术将NOD小鼠Prkdc和IL2rg双基因敲除而获得。该小鼠没有成熟T、B淋巴细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失，对人源组织几乎不存在排斥反应，免疫缺陷程度最高。同时其平均寿命长达1.5年，是进行人源细胞或组织移植最理想的模型小鼠。

总之，免疫缺陷小鼠种类较多，研究者可根据课题的需求及经费等方面综合考虑，选择不同免疫缺陷小鼠用以发挥最佳作用，为肝细胞癌的研究提供合适的PDX模型（见表1）。

表1 PDX模型常用免疫缺陷小鼠总结Table 1 Summary of immunodeficient mice commonly used in PDX model

2 肝细胞癌PDX模型移植部位和方法的选择

2.1 皮下移植 皮下移植实验操作简单易行，便于观察，是最常采用的方法。移植部位多选择头部皮下、腋下或双侧腹股沟。这些部位操作简单，肿瘤易成活，且易于观察肿瘤，肿瘤的生长也不会影响小鼠的正常活动。该方法常应用于肝细胞癌新药物筛选实验、药物疗效对比实验等研究[21-22]。但由于小鼠皮下缺乏肿瘤相关的微环境，很少会出现肿瘤的远处转移现象，因此这种方式不适用于构建分化程度高、恶性程度低的肿瘤移植模型[23]。

2.2 肝脏原位移植 肝脏原位移植的方式分为原位注射悬液与原位微组织块移植两种。原位注射悬液操作简单，部分研究者采用了此法[24]。原位微组织块移植是将肿瘤组织切成微组织块移植到与原发部位相同的动物脏器，也称为患者源性原位异种移植（patient-derived orthotopic xenograft,PDOX）。微组织块能够很好地保留人源肝脏肿瘤的微环境，而肿瘤周边的小鼠肝脏供给肿瘤生长所需营养，不但能够更好地模拟肝脏肿瘤的生长、浸润和转移，还能够保留患者肝脏肿瘤组织的异质性。相比于皮下移植方式，PDOX模型能够更准确地模拟肿瘤在人体内的进展全过程，同时更易出现与临床相似的肿瘤转移特征[25]。但原位移植手术操作相对复杂，成瘤率较低，而且不能直接观察，须剖腹才能顺利观察肿瘤的生长情况，是其发展推广的瓶颈。因此，研究者借助多项影像学技术手段，同时依托PDX模型来评价新型影像学技术在肝细胞癌早期的预防与诊断，对肝细胞癌的后续治疗与预后可提供宝贵的指导意见。Yang等[26]利用PET技术对肝癌细胞系、肝癌细胞移植模型和PDX模型进行了对比检测，评价PET对早期肝细胞癌的检测能力和预测能力。Zhang等[27]利用NIRF/PET双模成像探针对小鼠PDX、CDX模型及家兔肝细胞癌模型进行对比检测分析，以期成为肝细胞癌早期预测和检测的有力手段。

2.3 人源化异种移植模型 目前多数构建的PDX模型都有一个相同的缺陷，那就是缺乏人类的免疫大环境，因此研究者开发出人源化异种移植模型。在造模过程中，不仅移植人源肿瘤组织，还将其他人源组织和细胞导入或将人类某些特定基因敲入免疫缺陷动物体内，使移植的肿瘤能够更好地在与人类非常相似的免疫大环境中模拟生长[25，28]。Zhao等[29]在传统PDX模型的基础上，成功建立了肝细胞癌PDX人源化模型，即具备人类免疫系统的PDX模型，能够对肝细胞癌的免疫治疗效果进行评价。而Jiang等[30]利用 NOD/SCID/IL2rg−/−小鼠建立 PDX 模型，评价Glypican 3-CAR T细胞对肝细胞癌PDX模型的有效性以及对临床的指导意义。此类人源化异种移植模型的优势在于模拟了更加相似的人体肿瘤微环境和大环境，使肿瘤生物学行为充分表达，还可减少肿瘤传代过程中出现的组织差异，因此在肿瘤免疫学研究方面具有显著优势[31]。但该模型对技术要求较高，操作有一定难度，难以得到广泛应用。

综上所述，影响PDX模型构建的因素主要包括：①实验动物的选择。综合各项因素首选NOD/SCID小鼠和NOG小鼠。②肿瘤组织特性。肿瘤标本的病理类型、分化程度和恶性程度等对构建的模型影响也较大[32]。临床预后不良的患者，其肿瘤的分化程度低，恶性程度高，异种移植的成瘤率高，相反则低。③手术操作的影响。新鲜肿瘤标本从患者体内取出后，应以最快速度保存于4 ℃培养基中[33]，随后异体移植尽量在离体1 h内完成；手术操作的熟练程度及手术全程的无菌意识均影响成瘤率。

3 PDX模型在肝细胞癌研究中的应用

3.1 肝细胞癌发病机制研究 PDX模型多用于肝细胞癌的发病机制等研究。Zhao等[34]对肝细胞癌患者和相关PDX模型中CD133、CD90、CD44等因子的表达进行了定量检测，并与肿瘤患者和PDX模型的肿瘤和癌旁组织的免疫组化结果进行了验证。Matsuki等[35]应用2个PDX模型证实了新型分子靶向药物仑伐替尼具有通过抑制FGF信号通路活性抑制肝细胞癌肿瘤的增殖、转移及侵袭等作用。Cheung等[36]分别用进展期和非进展期肝细胞癌组织构建肝癌细胞系并建立PDX模型，为肝细胞癌的研究提供模型平台。Yang等[37]利用PDX模型进行全基因组测序，评价了以JAK1基因为代表的信号通路在肝癌发生、发展过程中的作用。Ding等[38]利用PDX模型分析了β-catenin在基因和蛋白水平上的激活状态。

3.2 临床前抗肿瘤药物疗效评估 PDX模型广泛用于肝细胞癌的临床前抗肿瘤药物疗效方面的研究，能够对肝细胞癌的临床治疗提供指导，同时对于新药的研发和应用具有很重要的意义。

3.2.1 PDX模型在肝细胞癌信号通路研究中的应用 目前，索拉非尼是抗肝细胞癌的一线药物，以索拉非尼为代表的分子靶向药物在进展期肝细胞癌治疗中发挥了重要作用，其抗癌机制是通过抑制多种丝氨酸/苏氨酸和受体酪氨酸激酶，从而抑制肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡等方面发挥作用[39]。虽然索拉非尼能够显著延长部分肝细胞癌患者的生存期，但还存在未能抑制的信号通路，如磷化硫醇3-激酶/蛋白激酶b信号通路[40]，这些信号通路反过来能够促进索拉非尼耐药细胞的生长和存活，从而出现更加难以克服的耐药现象。研究者利用PDX模型对索拉非尼的抗癌机制以及在抗癌过程中可能会影响其作用的生物标志和信号通路进行了深入的研究，同时也对开发其他抗肝细胞癌的药物和成分展开了研究。Wu等[41]通过建立PDX模型证明了利用CDK1抑制剂阻断CDK1/PDK1/β-Catenin信号通路能够增强索拉非尼抗肿瘤应答。Wang等[42]利用PDX模型研究发现抑制胰岛素样生长因子受体1（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R）的活性能够显著增强索拉非尼抑制肝癌细胞生长和存活的作用。Liang等[43]应用PDX模型验证pERK是评价索拉非尼治疗肝细胞癌时一项显著的生物标志物。当索拉非尼通过RAF/MEK/ERK通路发挥作用时，pERK会出现显著下调。Tao等[44]通过构建肝细胞癌PDX模型研究索拉非尼耐药组与敏感组中DKK1的表达差异，发现通过降低DKK1表达可增强索拉非尼的敏感性。

3.2.2 PDX模型在肝细胞癌药物敏感性方面的研究应用 PDX模型因保留患者肿瘤的分子特性和异质性，能够再现患者的药物敏感性特征，被广泛应用于肝细胞癌临床前药物敏感性研究。Kissel等[21]以瑞戈非尼和索拉非尼为模型药物，比较了H129小鼠肝癌模型和PDX模型对抗肿瘤药物的敏感性差异。Lv等[22]利用肝癌细胞系和PDX模型评价了Vc通过SVCT-2对肝细胞癌的抑制作用。许多研究发现，PDX模型对抗癌药物的反应与提供肿瘤样本的实际患者反应相似[47]。因此，PDX模型有助于测试某些药物的治疗反应，并且可以从异种移植组织获得治疗后数据[48]。表2总结了肝细胞癌PDX模型相关研究的文献资料。另外，我们还注意到，在其他类型肿瘤如肺癌、肠癌等研究中，应用上海立迪生物技术股份有限公司新型开发的OncoVee®MiniPDX （MiniPDX） 模型进行药物敏感性试验，对临床用药起到指导性作用[49-50]。MiniPDX模型将患者或PDX来源的肿瘤细胞注入改良的微胶囊和中空纤维培养体系后置入小鼠皮下，其整合了中空纤维和PDX模型的优点，将体外分离肿瘤原代细胞与体内药物敏感测试结合起来，可在7 d内获得临床针对该患者治疗药物敏感性的试验结果，因此该模型能够满足肿瘤晚期或进展期患者治疗药物选择的迫切需求[51]。但是目前肝癌的MiniPDX模型报道还很少见，可以作为未来研讨和深入研究的方向。

表2 肝细胞癌PDX模型相关文献总结Table 2 Summary of literature on hepatocellular carcinoma PDX models

4 PDX模型相关研究存在的问题

PDX模型是肝细胞癌基础研究的重要手段之一，目前肝细胞癌PDX模型研究已取得一些进展，但仍存在诸多局限性和挑战：①与肺癌、胃癌以及乳腺癌等相比，肝细胞癌相关PDX研究报道数量相对较少，研究不够深入。②在临床肿瘤体积很大的情况下，需要病理学家和外科医生的协助选取更合适的肿瘤组织作为后续研究的标本。③现有的PDX模型多数是利用肝细胞癌组织标本建立原代细胞系后移植于裸鼠皮下，难以反映肿瘤细胞在肝脏原位的生长情况。④PDX模型的建模周期较长，通常需要2～8个月。⑤部分患者肿瘤的移植成瘤率比较低。⑥免疫缺陷小鼠传代至3～5代时，原代肿瘤的基质成分会被小鼠基质所代替。尽管与现有细胞系相比，原代细胞系更加接近和反映患者的个体特性，但在制备PDX的过程中，肿瘤细胞遗传背景是否能够保持稳定，目前尚无高效、准确以及公认的检测方法。⑦现有肝脏肿瘤标本的保存策略主要是保存蜡块和冷冻标本，或冻存原代细胞系，对组织的保存与利用不足。⑧目前应用PDX模型进行肝细胞癌相关药物敏感检测的报道仍旧极少。⑨研究成本相对较高，由于免疫缺陷小鼠价格昂贵，肿瘤的形成需要很长的时间，因此开发PDX模型需要很高的成本。

正因为肝细胞癌PDX模型有上述诸多困难需要克服，其应用并不如其他类型肿瘤PDX模型更加广泛。但由于其具有独特性和诸多优势，肝细胞癌PDX模型仍然被认为是一种有价值的临床前研究工具。

5 总结与展望

综上所述，尽管肝细胞癌PDX模型存在一些局限性，但该模型在药物筛选、生物标志物开发和联合临床试验等临床前试验中具有的优势已经越来越显著。肝细胞癌PDX模型还有利于肿瘤患者个性化药物的筛选，能够更好地实现肿瘤的精准医疗。利用PDX模型为肝细胞癌患者选择更有效的药物，既能节省治疗费用，又尽可能提高了患者生存率和生活质量。尤其在出现复发转移后，还有助于临床二、三线药物的选择[60]。对于肝细胞癌PDX模型缺乏人源化免疫系统的短板，研究者不断探索将人的造血干细胞移植于X线照射的重度免疫缺陷小鼠，再将患者的肿瘤组织移植于该小鼠形成人源化肿瘤模型[61-62]。此类模型可以很好地模拟人体内的生长环境，多用于研究肝脏肿瘤靶向治疗，尤其适用于肿瘤免疫治疗方面的研究[63]。目前，研究者应用肝细胞癌PDX模型不断深入地探索肝细胞癌发生发展的原因，可协助对肝细胞癌临床治疗提出多样化和个性化的方案，期待肝细胞癌PDX模型在未来的转化医学和精准医疗方面能够发挥更强的作用。