聚苯胺超分子水凝胶固定化果胶酶的研究

郝红英，马金玲，詹海鹃，刘万毅，毕淑娴

（宁夏大学化学化工学院，省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，宁夏 银川 750021）

果胶酶是一种可以使果汁、果酒澄清，降低果胶加工过程中营养物质损耗的一种酶。降低果蔬等榨汁的黏度、提高过滤效率的同时减少化学澄清剂的用量，从而改善果汁的质量[1]。游离的果胶酶具有反应后不能回收、不能实现重复利用等缺点。而固定化酶在一定程度上弥补了这些缺点，还能防止外源物质对果品的污染，提高酶的使用效率[2-6]。

水凝胶是通过物理交联或化学交联，而得到的具有三维网络结构体系的亲水高分子聚合物。不溶于水，但能吸收大量的水溶胀。正是由于这样的结构特征，水凝胶才会被大量地应用于细胞分离与培养、药物控制释放、固定化酶等领域[7-10]。

本文以戊二醛（glutaraldehyde，GA）为交联剂制备聚苯胺基超分子-戊二醛（polyaniline based supramolecular hydrogels-glutaraldehyde，PPH-GA）复合材料作为酶的固定化载体，固定果胶酶并研究其催化性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3-氨基苯硼酸盐（98%）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：天津市凯通化学试剂有限公司；苯胺（aniline，AN）、过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）：烟台市双双化工有限公司；戊二醛：天津市大茂化学试剂厂；浓盐酸：天津市北联精细化学品开发有限公司；氢氧化钠、无水亚硫酸钠、果胶酶（>50 000 U/g）：上海瑞永生物科技有限公司；柠檬酸：徐州天鸿化工有限公司；柠檬酸钠、果胶、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸：上海广诺化学科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器

RH数显型磁力搅拌器：德国艾卡公司；JD200-4电子分析天平：沈阳龙腾电子有限公司；D2F-6050真空干燥箱：上海慧泰仪器制造有限公司；SHA-C数显恒温振荡器：金坛市杰瑞尔电器有限公司；UV-1800PC紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；PSHJ-5 pH计：西安精密仪器仪表有限公司。

1.3 固定化酶的制备及其性能研究

1.3.1 固定化酶载体制备

先将2 mmol过硫酸铵（APS）溶于1 mL去离子水作为A溶液。将1.5 mmol的苯胺（AN）加入3 mL 10%去离子水制得的聚乙烯醇溶液，再加入0.105 mmol的3-氨基苯硼酸盐酸盐、800 μL 6 mmol/L 的 HCl和197.5 μL去离子水混合作为B溶液。将上述溶液A和溶液B冷却至0℃，取802.5 μL溶液A与溶液B迅速混合，反应6 h。将4%戊二醛（GA）和PPH按一定比例加入小烧杯中，磁力搅拌交联10 h后用蒸馏水反复离心洗涤多次，制备出PPH-GA复合材料[11]。

1.3.2 材料表征

1.3.2.1 傅立叶红外光谱分析（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）

采用KBr压片法，在光谱范围为4 000 cm-1～500 cm-1，分辨率为0.5 cm-1的条件下，用红外光谱仪测定PPHGA复合材料的结构特征。

1.3.2.2 扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）

采用SEM测试方法，在不同的放大倍数下观察PPH-GA复合材料的形貌特征。

1.3.3 固定化酶的制备

1.3.3.1 3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）试剂的配制

称取3，5-二硝基水杨酸10 g溶于蒸馏水中，加入20 g氢氧化钠、200 g酒石酸钾钠和500 mL水加热溶解。之后加入5 g苯酚、5 g无水亚硫酸钠，待全部溶解后定容至1 000 mL，储存于棕色瓶中，放置7 d后使用。

1.3.3.2 pH 3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的配制

称取柠檬酸21.01 g溶解后定容至1 000 mL。称取29.41 g柠檬酸钠溶解后定容至1 000 mL。取一定量的柠檬酸、柠檬酸钠溶液混合用pH计测定pH值为3.5。

1.3.3.3 1%果胶溶液的配制

用分析天平称取果胶1 g用pH 3.5的缓冲溶液溶解，定容至100 mL。

1.3.3.4 1%果胶酶溶液的配制

用分析天平称取果胶酶1 g用pH 3.5的缓冲溶液溶解，定容至100 mL。

1.3.3.5 固定化酶的制备

称取制备的PPH-GA复合材料0.08 g，加入1%果胶酶溶液2 mL，在37℃恒温振荡器中反应4 h。取出后倒出上清液保存，待测载酶量。沉淀先用蒸馏水清洗，再用缓冲溶液清洗除去多余的自由酶。放置4℃冰箱中保存。

1.3.4 固定化果胶酶酶活力的测定

在固定化果胶酶中加入2 mL HAc-NaAc缓冲液（pH 3.5），40℃水浴平衡5 min，再加入1 mL预先平衡至40℃的1%的果胶溶液，40℃水浴反应30 min，取出固定化酶，将反应液立即在沸水浴中煮5 min使酶失活，冷却。从反应液中取2 mL于试管中，用DNS法测定其还原糖含量。酶活力单位定义同自由果胶酶的活力单位[12]。

1.4 单因素试验

1.4.1 酶浓度对酶活力的影响

配制 0.05%、1%、2%、3%、4%、5%的果胶酶溶液，按照固定化酶的制备方法制备不同浓度的固定化果胶酶。在温度为40℃，pH 3.5的条件下测其酶活力，并比较自由酶的酶活。

1.4.2 温度对固定化酶活力的影响

分别在温度为 25、30、35、40、45、50 ℃，酶浓度为3%，pH 3.5的条件下测定固定化酶和自由酶的酶活。

1.4.3 pH值对酶活力的影响

分别在 pH 值为 2.6、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，温度为40℃，酶浓度为3%的条件下测定自由酶和固定化酶的活力。

1.4.4 反应时间对酶活力的影响

分别在反应时间为 15、30、45、60、90、120、150 min，温度为40℃，酶浓度为3%，pH 3.5的条件下测定自由酶和固定化酶的活力。

1.4.5 果胶浓度对酶活力的影响

配制 0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、2.0%浓度的果胶溶液，在温度为40℃，酶浓度为3%，pH 3.5，反应时间为120 min的条件下测定固定化酶和自由酶的酶活。

2 结果与分析

2.1 固定化酶载体的表征

载体的FT-IR谱图见图1。

图1 PPH-GA的红外光谱分析图Fig.1 Infrared spectrum analysis of PPH-GA

由图1可知，聚苯胺基超分子水凝胶-戊二醛在3 435、1 302 cm-1处有吸收峰，该峰归因于N-H键和C-N 键的伸缩振动；1 646、1 557、798 cm-1处的吸收峰归因于苯环的伸缩振动；在1 403 cm-1的吸收峰归因于C-H键的伸缩振动。1 213 cm-1处的峰归因于聚乙烯醇（polyvingl alcohol，PVA）分子C-O键的伸缩振动。复合材料的官能团特征峰明显，表明丰富的官能团能较好地键合在材料表面。

载体的SEM谱图见图2。

图2 PPH-GA复合材料SEM图Fig.2 SEM of PPH-GA composite

由图2可知，PPH-GA复合材料具有三维网状结构，且孔径大，有利于酶的固定化。

2.2 固定化果胶酶活力

固定化果胶酶活力见表1。

表1 一定反应条件下自由酶和固定化酶的活性参数Table 1 Activity parameters of free enzyme and fixed enzyme under certain reaction conditions

由表1可知，在最佳反应条件下固定化酶的催化活力是203.4 U/mg。计算出的固定化酶的载酶量为268.1 mg/g。

2.3 不同酶浓度对酶活的影响

不同酶浓度对酶活的影响见图3。

图3 不同酶浓度对酶活的影响Fig.3 Effect of different enzyme concentration on enzyme activity

对于纯酶来说，一般认为在pH值、反应温度和反应底物浓度相同时，酶的催化能力与酶的浓度成正比关系。由图3可知，固定化酶的活力随酶浓度的增大而提高，但当酶浓度增大到一定程度后，固定化酶的活力开始下降，自由酶亦然，这是由于载体的结合位点有限，酶浓度过大时，造成载体的空间位阻过大，底物与产物不能够在第一时间分散，使得固定化酶的催化能力降低。因此，固定化酶最佳酶浓度为3%。

2.4 不同温度对固定化酶活力的影响

不同温度对酶活的影响见图4。

图4 不同温度对酶活的影响Fig.4 Effect of different temperature on enzyme activity

与一般化学反应一样，当温度升高，酶解反应速率会加快，同时酶的活性也会随之降低。由图4可知，固定化酶和自由酶的活力都是先增大再减小的。在一定温度范围内固定化酶和自由酶的相对酶活增幅较大，说明温度对酶活性的影响较明显。固定化酶最佳反应温度为40℃。

2.5 不同pH值对酶活力的影响

不同pH值对酶活力的影响见图5。

图5 pH值对酶活的影响Fig.5 Effect of pH on enzyme activity

酶是一种蛋白质，反应体系的pH值影响酶分子活性部位中催化基团与结合基团的解离状态，同时也影响着底物的解离状态，对酶分子的空间结构和专一性也有一定的影响。酶的最适pH值并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。由图5可知，固定化酶的最佳pH值为3.5，自由酶的最佳pH值为3.0。与自由酶相比较固定化酶的pH值范围更广。

2.6 不同反应时间对酶活力的影响

不同反应时间对酶活力的影响见图6。

由图6可知，自由酶的最佳反应时间为90 min，固定化酶的最佳反应时间为120 min。反应时间过长，酶活力降低的原因可能是底物被分解为其他物质。

图6 反应时间对酶活的影响Fig.6 Effect of reaction time on enzyme activity

2.7 不同果胶浓度对酶活力的影响

不同果胶浓度对酶活力的影响见图7。

图7 不同果胶浓度对酶活的影响Fig.7 Effect of pectin concentration on enzyme activity

由图7可知，不同果胶浓度对自由酶和固定化酶的影响不同,固定化酶的酶活力随着果胶浓度的增大呈增大趋势，固定化酶最佳果胶浓度为2%。自由酶活力呈先增大后减小的趋势，自由酶最佳果胶浓度为1.0%。

3 结论

本研究制得了性能较好的PPH-GA复合材料,通过FT-IR发现PPH-GA复合材料的官能团特征峰明显,材料表面较好地键合了丰富的官能团。SEM发现PPH-GA材料具有三维网状结构，有较大的孔径，具有良好的固酶特性。经试验测得固定化酶的载酶量为268.1 mg/g。并且通过单因素试验得出固定化果胶酶在pH3.5，反应温度为40℃，酶浓度为3%，反应时间为120 min，果胶浓度为2%时，具有最高活性。固定化果胶酶比自由酶更稳定，并且固定化果胶酶可以回收重复利用，既避免了自由酶易失活，不能长期保存的问题，也在一定程度上降低了成本，为固定化酶的研究提供了理论基础。