miRNA101对人牙囊细胞成骨分化的影响

张 骢，刘 畅

（吉林大学口腔医院正畸科，长春 130021）

牙囊属于一种松散的外胚间源性结缔组织，它在萌发期间围绕着正在发育的牙胚［1］。牙囊细胞来自于牙胚发育中的牙囊组织，被认为是成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞的前体细胞。以往研究表明，牙囊细胞具有多向分化潜能，其在一定条件诱导下可向成骨方向分化牙囊细胞包含由牙周膜（PDL），牙槽骨和矿化的牙骨质组成的牙周组织的祖细胞，它对于牙根和牙齿发育的协调至关重要［2-3］。文献研究表明，分离的人类牙囊细胞（DFC）能够分化成矿化细胞。而人口腔中的钙化组织就是由牙齿成牙骨质样细胞或由牙槽骨成骨细胞样细胞组成［4-5］。然而，牙囊细胞向功能细胞（如成骨细胞/成牙骨质细胞）分化的调节机制仍知之甚少。因此，如何诱导牙囊细胞成骨定向分化成为牙齿硬组织结构再生研究的关键之一［6］。

微小RNA（miRNA）是干细胞生长发育中非常重要的调节因子［7］。这些短的RNA（大约22nt）是属于一类非编码内源性RNA，可以通过结合其靶蛋白的编码信使RNA（mRNA）的30个非翻译区来调节基因表达［8］。而且，miRNA能够通过转录后基因的表达沉默来影响翻译抑制和mRNA分裂［9］。在胚胎干细胞自我更新中miRNA同样起着关键的作用，而且它们对于调节干细胞分化、骨骼肌发育、神经发生、压力和免疫反应都有着非常重要的作用［10-11］。一个miRNA可以靶向数百个基因，同样，一个基因则可以被多个miRNA靶向调控，然后有研究报道，miRNA更倾向与靶向调控转录因子［12］。

虽然关于miRNA调控成骨转录分化的研究很多，但是直到目前为止，DFCs中miRNA表达与成骨转录因子的表达之间的关系仍然未被阐述清楚。为了研究miRNA在DFC成骨分化过程中的作用，本研究采用体外转染和RT-PCR技术，研究了miRNA101在牙囊细胞成骨分化期间的差异表达，首次揭示了miRNA101在人牙囊细胞成骨分化过程中的关键作用。

1 资料与方法

1.1 仪器和试剂DMEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；胰蛋白酶（Gibco，美国）；总RNA抽提试剂盒（Giagen GmbH公司，德国）；逆转录反应和实时定量聚合酶链反应（quantitativereal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）；试剂盒（TaKaRa公司，日本）；超净工作台（ESCO，加拿大）；细胞培养箱（Thermo Scientific，美国）；DFCs（ALL Cells，美国）；miRNA101模拟物（Qiagen，Hilden，Germany）；RT-PCR仪（Bio-rad，美国）；引物由软件primer5设计，Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养DFCs培养于含10% FBS、1%青链霉素的DMEM培养基中，温度37℃，CO2含量5%。每两天换液一次，待细胞长满皿底70%～80%时用0.25%胰酶按1：2 传代，取第3 代细胞用于实验。

1.2.2 成骨分化诱导为了成骨分化，将基本培养基替换为诱导成骨分化的培养基（ODM）。ODM的组成成分为：DMEM、10%FBS、10-7M地塞米松、100mM磷酸抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸和20mM HEPES缓冲液。

1.2.3 转染和RNA分离细胞以每孔6×104个接种于6孔板，当细胞密度达到80%～90%时，进行miRNA转染实验。miRNA-101用无血清培养稀释至5mM，然后加入HiPerfect转染试剂，混合均匀，室温孵育15～20min（具体操作步骤见试剂盒说明书），乱序siRNA作为对照。然后将转染复合物加入孔板中，于孵箱中培养24h。孵育24h后更换完全培养基继续培养48h。实验终点时用miRNeasy mini Kit提取总RNA。用miScript miRNA PCR Array 试剂盒进行PCR分析，具体操作见试剂盒说明书。

1.2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性检测细胞以每孔6×104个接种于6孔板，miRNA转染48h后，收集各组细胞裂解液，采用LabAssayTM ALP检测试剂盒检测细胞裂解液中的ALP活性。各组细胞裂解液的ALP活性值均用相应的细胞总蛋白浓度予以校准，求得各组ALP活性值。

1.2.5 qRT-PCR检测成骨相关基因的表达细胞以每孔1×105个接种于6孔板，转染诱导后48h，采用RNeasy Mini Kit和RNase-Free DNase Set试剂盒抽提细胞总RNA，经逆转录反应合成相应cDNA，β-actin为内参基因。配制real-time PCR 10μL反应体系，进行qRTPCR定量检测分析（具体应参数及操作步骤均参考试剂盒使用说明书）。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.3 统计学分析SPSS 17.0软件进行统计分析，行单因素方差分析，以LSD法进行两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨分化对miRNA101表达的影响ODM培养基诱导DFCs成骨分化第3天和第7天进行总RNAs提取和检测。结果见图1。结果显示，与正常培养基相比，ODM培养基诱导第3天时miRNA101的表达略微升高，没有显著性差异。ODM培养基诱导第7天时，miRNA101的表达显著升高，实验结果具有统计学差异。

图1 诱导DFCs成骨分化对miRNA101表达的影响（**P<0.01，n=3）

2.2 miRNA101模拟物对成骨分化相关基因表达及ALP活性的影响为了探讨miRNA101对DCFs成骨分化的影响，本研究用miRNA101模拟物体外转染DFCs细胞。并用miScript miRNA PCR Array检测miRNA101表达情况；LabAssayTM ALP检测试剂盒检测ALP活性；qPCR检测成骨分化相关基因表达情况，结果见图2、图3和图4。由图2结果可知，与Control组和siNT组相比，miRNA101模拟物转染过后显著增加miRNA101的表达。为探讨miRNA101高表达过后DFCs成骨分化情况，实验进一步检测了ALP活性及成骨相关基因OCN和Runx2的表达情况，结果见图3和图4。由实验结果可知，与对照组相比，miRNA101高表达组的ALP活性显著增加，结果具有统计学差异。成骨相关基因Rnux2和ALP mRNA的表达也显著升高，而OCN mRNA的表达不受miRNA101表达的影响。实验结果提示miRNA101能够促进DFCs细胞的成骨分化。

图2 miRNA101模拟物对DFCs的miRNA101表达的影响（***P<0.001，n=3）

图3 miRNA101模拟物对DFCs的ALP活性的影响（***P<0.001，n=3）

图4 miRNA101模拟物对成骨分化相关基因表达的影响（**P<0.01，n=3）

2.3 miRNA101对成骨转录因子SATB2表达的影响为进一步探讨miRNA101诱导成骨分化的相关机制，实验进一步测定了成骨相关标记物的表达情况。结果表明miRNA101转染过后成骨转录因子SATB2的基因表达显著增加（见图5）。实验结果表明miRNA101参与DFCs的成骨分化，可能机制为调控成骨转录因子SATB2的表达。

图5 miRNA101模拟物对成骨转录因子表达的影响（***P<0.001，n=3）

3 讨论

外胚间充质干细胞DFCs的使用对于体外研究牙槽成骨细胞和成牙骨质细胞分化具有非常大的好处，在临床应用中也具有巨大的前景［4］。尽管迄今为止对DFC中成骨分化的信号传导途径有了很深入的研究，但是对于miRNA在DFCs成骨分化中的作用仍然难以阐述清楚。研究表明miR144、miR125b和miR-20a在小鼠和人的3T3细胞、间充质干细胞以及人脂肪组织来源的干细胞的成骨分化中具有重要的调节作用［13-15］。但是关于miRNA对DFCs成骨分化的作用及其具体机制尚未有深入研究。

本实验研究中表明，在长期培养的DFC中，miRNA101的基因表达显著增加。而与标准培养基相比，在ODM培养基的诱导下，miRNA101的表达进一步显著增加。有研究表明miRNA101能够抑制在矿化性牙周膜细胞中差异表达的PLAP1的表达，而PLAP-1是公认的抑制的牙周韧带矿化的负调节因子［16］。这些研究表明miRNA101能够通过影响成骨分化标志物的表达而参与调节成骨分化相关因子的表达。本研究还发现miRNA101模拟物转染DFCs后显著增加了成骨分化相关标志物的表达及ALP活性。而且miRNA101尤其增加了DFC中SATB2的表达，SATB2作为成骨分化的重要转录因子，对DCFs成骨起到重要调节作用［17］。

本研究首次揭示了miRNA101可能通过调控DCFs中成骨转录因子SATB2的表达来调节成骨分化。由于SATB2为新近发现的转录因子，其转录调控功能区域（包括启动子区、增强子区）的具体定位尚不明确，有待进一步深入探索。鉴于SATB2 在成骨分化中的核心作用，其具体机制的进一步研究将推动骨形成机制的阐明及相关骨代谢疾病的合成治疗，具有巨大的市场应用前景。

本研究证明了miRNA101具有明显的促进人牙囊细胞成骨细胞分化的效果，并且其可能机制通过调节成骨分化关键转录因子SATB2的表达来调节DFCs的成骨分化。